一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用，属于生物技术领域。一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S1，进行鼠单抗制备；S2，加入5mL的DMEM培养基混匀；S3，进行腹水制备；S4，抗体纯化；S5，进行重组抗体制备，首先进行RNA提取；S9，进行cDNA制备，然后进行质粒制备；S10，抗GFAP重组抗体表达及纯化，包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测；S11、进行抗体验证；本发明专利技术与传统单克隆抗体相比，重组抗体具有序列已知、抗体基因可长期保存、抗体性质稳定、实验重复性好等优点，是一种标准化的抗体生产流程，回避了传统单克隆抗体生产保存过程中出现的风险因素。

【技术实现步骤摘要】
一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物技术
，尤其涉及一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用。
技术介绍
GFAP是胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞活化的标志物，神经胶质纤维酸性蛋白是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在，星形胶质细胞广泛分布于中枢神经系统各个部位，约占正常成年人脑细胞总数的40％，GFAP则是星形胶质细胞特有的中间丝蛋白，研究发现星形胶质细胞在发育成熟后GFAP表达明显增加并贯穿一生，GFAP小鼠中，星形胶质细胞的中间丝显著减少甚至完全没有。因此GFAP不仅被认为是星形胶质细胞的成熟标志，也成为正常及病理情况下应用最广泛的星形胶质细胞标记物。正常情况下，在细胞胞质内的GFAP循环降解，血液中GFAP水平较稳定；然而病理条件下，如病人的中枢神经系统受到损伤，其星形胶质细胞遭受破伤或坏死时，GFAP从胶质细胞中流出，穿过血脑屏障进入血液中，使GFAP浓度上调。目前市场上抗GFAP单抗产品数量较少，从市面上已经制备成功的例子来看，免疫原多为天然蛋白，也有大肠和293T细胞表达。市面上该项目产品可分为鼠单抗和兔单抗。市面上抗GFAP单克隆抗体应用也相对较少，其中在WB、IHC、IF、FC等实验中一般只通过一至两种验证。GFAP单抗是干细胞单克隆抗体中的一个重要项目，但是目前通过了FC验证的产品仅两个，FC区分度在10倍左右。传统单克隆抗体，可以通过相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体，且可通过不同筛选手段，获得不同表型的特异性抗体。杂交瘤细胞具有无限增殖能力，理论上可以一直使用，不断产生完全相同的单抗，但实际在长期使用后杂交瘤细胞存在退化的情况，效价会下降，另外可能由于保存等原因，细胞株存在抗体染色体丢失、细胞复苏后停止生长或者死亡等风险。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种多功能抗GFAP单克隆抗体，其含有由SEQIDNO：1和SEQIDNO：4所示的CDR1、由SEQIDNO：2和SEQIDNO：5所示的CDR2以及由SEQIDNO：3和SEQIDNO：6所示的CDR3。优选的，该抗体可以特异性识别GFAP蛋白。优选的，该抗体可以应用于抗体验证。一种制备多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S1，进行鼠单抗制备，首先快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化；S2，加入5mL的DMEM培养基混匀，在超净台操作，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％完全培养基，37℃5％CO2培养箱内培养，传代培养；S3，进行腹水制备；S4，抗体纯化；S5，进行重组抗体制备，首先进行RNA提取，复苏细胞，然后检测细胞株效价，采用半皿或者1/4皿收集细胞；S6，加1mlTrizol，吹匀至细胞完全溶解，然后加入200μl氯仿，上下剧烈颠倒，静置2min，在12000rpm4℃15min离心取上清；S7，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置10min；然后12000rpm4℃10min离心，弃上清；S8，加1ml预冷75％乙醇，轻弹管底，12000rpm4℃3min离心，弃上清，室温晾干数分钟，然后加30-50μl预冷的DEPC水至溶解即得到RNA产物，-80℃长期保存；S9，进行cDNA制备，然后进行质粒制备；S10，抗GFAP重组抗体表达及纯化，包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测；S11、进行抗体验证。优选的，步骤S5-步骤S8中整个提取过程必须带口罩与手套，防止RNase的污染。优选的，步骤S11中抗体验证的方法包括：WB验证、IF验证、FC验证、IHC验证。一种采用多功能抗GFAP单克隆抗体的应用。与现有技术相比，本专利技术提供了一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法及其应用，具备以下有益效果：1、该多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，与传统单克隆抗体相比，重组抗体具有序列已知、抗体基因可长期保存、抗体性质稳定、实验重复性好等优点，是一种标准化的抗体生产流程，回避了传统单克隆抗体生产保存过程中出现的风险因素。2、该多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，本文中的抗GFAP鼠单抗及重组抗体同时通过WB、IF、IHC、FC验证，对比市场上其他抗体，应用范围广，抗体特异性更好。附图说明图1为本专利技术中WB验证结果的结构示意图；图2为本专利技术中IF验证结果的结构示意图一；图3为本专利技术中IF验证结果的结构示意图二；图4为本专利技术中IF验证结果的结构示意图三；图5为本专利技术中FC验证结果的结构示意图；图6为本专利技术中IHC验证结果的结构示意图一；图7为本专利技术中IHC验证结果的结构示意图二。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。在本专利技术的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。实施例1:一种多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S1，进行鼠单抗制备，首先快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化；S2，加入5mL的DMEM培养基混匀，在超净台操作，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％完全培养基，37℃5％CO2培养箱内培养，传代培养；S3，进行腹水制备，腹水制备的具体方法为：a.提前一周将小鼠腹腔注射不完全佐剂，每只注射0.5mL；b.离心收集传代好的细胞，用1mLDMEM重悬，浓度为1×106/mL，用无菌注射器吸取细胞，注射到小鼠腹腔；c.间隔6天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时有紧张感，即可用无菌注射器腹水针采集腹水；d.10000rpm离心5min，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清，-20℃保存；S4，抗体纯化，抗体纯化的具体方法为：a.取亲和层析柱，水洗10倍柱床体积，乙酸钠缓冲冲洗10倍柱床体积；b.腹水，4℃，12000rpm离心10min，收集上清，过滤，然后腹水与1％乙酸钠缓冲液1：4体积比混合，以0.5mL/min的速度上样，收集穿透；c.上样结束后，继续以乙酸钠缓冲冲洗至G250检测无色，用3.5％冰乙酸，PH＝2.7的洗脱缓冲冲洗柱床，收集洗脱峰；...

【技术保护点】
1.一种多功能抗GFAP单克隆抗体，其特征在于，其含有由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的CDR1、由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示的CDR2以及由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示的CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种多功能抗GFAP单克隆抗体，其特征在于，其含有由SEQIDNO：1和SEQIDNO：4所示的CDR1、由SEQIDNO：2和SEQIDNO：5所示的CDR2以及由SEQIDNO：3和SEQIDNO：6所示的CDR3。


2.根据权利要求1所述的多功能抗GFAP单克隆抗体，其特征在于，该抗体可以特异性识别GFAP蛋白。


3.根据权利要求1所述的多功能抗GFAP单克隆抗体，其特征在于，该抗体可以应用于抗体验证。


4.一种制备权利要求1所述的多功能抗GFAP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，进行鼠单抗制备，首先快速将细胞冻存管从液氮罐中取出，置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化；
S2，加入5mL的DMEM培养基混匀，在超净台操作，1200rpm离心5min，弃上清，加入20％完全培养基，37℃5％CO2培养箱内培养，传代培养；
S3，进行腹水制备；
S4，抗体纯化；
S5，进行重组抗体制备，首先进行RNA提取，复苏细胞，然后检测细胞株效价，采用半皿或者1/4皿收集细胞；
S6，加1mlTri...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐娅，袁文文，于倩，李晶晶，张芳，易汪雪，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42