靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体制造技术

本发明专利技术提供了用于治疗癌症的方法和组合物，所述方法和组合物可以有利地通过靶向肿瘤微环境来实现。本发明专利技术提供了靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体(CAR)。在一个方面，本发明专利技术的特征在于免疫细胞，其经工程化以表达：(a)包含细胞外结构域的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述细胞外结构域包括结合第一抗原的第一抗原结合结构域和结合第二抗原的第二抗原结合结构域；和(b)双特异性T细胞接合器(BiTE)，其中所述BiTE结合靶抗原和T细胞抗原。在另一个方面，本发明专利技术的特征在于包含所述免疫细胞的药物组合物。在另一个方面，本发明专利技术的特征在于在有需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括给予所述免疫细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体相关申请的交叉引用本申请要求以下申请的权益：2018年2月12日提交的美国临时申请号62/629,593；2018年4月16日提交的美国临时申请号62/658,307；2018年4月16日提交的国际专利申请号PCT/US2018/027783；以及2018年10月17日提交的美国临时申请号62/746,895；将它们的内容通过引用以其全文并入本文。
本文所述的技术涉及免疫疗法。序列表本申请含有以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其全文并入的序列表。在2019年2月12日创建的ASCII副本命名为51295-013WO2_Sequence_Listing_2.12.19_ST25并且大小为190,819字节。专利技术背景嵌合抗原受体(CAR)提供了一种将细胞毒性T细胞应答定向至表达所选靶抗原(最常见的是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原)的靶细胞的方式。CAR是T细胞受体的改型物，其中抗原结合结构域被特异性结合衍生性靶抗原的抗体的抗原结合结构域替代。在例如T细胞(“CART细胞”或“CAR-T”)上表达的CAR对在靶细胞表面上的靶抗原的接合促进了对靶细胞的杀伤。
技术实现思路
本专利技术提供了靶向肿瘤微环境的嵌合抗原受体(CAR)。在一个方面，本专利技术的特征总体上在于免疫细胞，其经工程化以表达：(a)包含细胞外结构域的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述细胞外结构域包括结合第一抗原的第一抗原结合结构域和结合第二抗原的第二抗原结合结构域；和(b)双特异性T细胞接合器(BiTE)，其中所述BiTE结合靶抗原和T细胞抗原。在一些实施方案中，所述CAR多肽包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR多肽进一步包含一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，所述第一和第二抗原是胶质母细胞瘤抗原。在进一步的实施方案中，所述第一和第二抗原独立地选自表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、CD19、CD79b、CD37、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、白介素-13受体α2(IL-13Rα2)、肝配蛋白A型受体1(EphA1)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)或细胞表面相关粘蛋白16(MUC16)。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括抗体的抗原结合片段，例如，单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。在其他实施方案中，所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括所述第一和/或第二抗原的配体。在进一步的实施方案中，所述细胞外结构域在所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域之间不包括接头。在其他实施方案中，所述第一抗原结合结构域通过接头连接至所述第二抗原结合结构域，例如，其中所述接头包含氨基酸序列SEQIDNO:102、107、108、109或110，或包括与接头SEQIDNO:102、107、108、109或110具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。在一些实施方案中，所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。在特定实施方案中，所述跨膜结构域包括CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含氨基酸序列SEQIDNO:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104，或与氨基酸序列SEQIDNO:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含氨基酸序列SEQIDNO:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106，或与氨基酸序列SEQIDNO:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1BB、CD27、CD28或OX-40的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域包括4-1BB的共刺激结构域，其任选地包含氨基酸序列SEQIDNO:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105，或与氨基酸序列SEQIDNO:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包括IL-13Rα2结合结构域。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包括EGFRvIII结合结构域。在一些实施方案中，所述IL-13Rα2结合结构域包括抗IL-13Rα2scFv或IL-13Rα2的配体。在一些实施方案中，IL-13Rα2的所述配体包括IL-13或IL-13泽塔因子(zetakine)或其抗原结合片段。在进一步的实施方案中，所述IL-13Rα2结合结构域包含氨基酸序列SEQIDNO:101，或包含与氨基酸序列SEQIDNO:101具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，所述EGFRvIII结合结构域包括抗体的抗原结合片段，例如其中所述EGFRvIII结合结构域包括抗EGFRvIIIscFv。在一些实施方案中，所述抗EGFRvIIIscFv包含含有氨基酸序列SEQIDNO:111或113的重链可变结构域(VH)、或含有具有与氨基酸序列SEQIDNO:111或113至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH；和/或含有氨基酸序列SEQIDNO:112或114的轻链可变结构域(VL)、或含有与氨基酸序列SEQIDNO:112或114具有至少90％序列同一性(例如，90％、91％、92％、93％与的具有94％、95％、96％、97％、98％或99本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：/n(a)包含细胞外结构域的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述细胞外结构域包括结合第一抗原的第一抗原结合结构域和结合第二抗原的第二抗原结合结构域；以及/n(b)双特异性T细胞接合器(BiTE)，其中所述BiTE结合靶抗原和T细胞抗原。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180212 US 62/629,593;20180416 US 62/658,307;20181.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：
(a)包含细胞外结构域的嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述细胞外结构域包括结合第一抗原的第一抗原结合结构域和结合第二抗原的第二抗原结合结构域；以及
(b)双特异性T细胞接合器(BiTE)，其中所述BiTE结合靶抗原和T细胞抗原。


2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述CAR多肽包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。


3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述CAR多肽进一步包含一个或多个共刺激结构域。


4.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第一和第二抗原是胶质母细胞瘤抗原。


5.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第一和第二抗原独立地选自表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、CD19、CD79b、CD37、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、白介素-13受体α2(IL-13Rα2)、肝配蛋白A型受体1(EphA1)、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、细胞表面相关粘蛋白1(MUC1)或细胞表面相关粘蛋白16(MUC16)。


6.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括抗体的抗原结合片段。


7.根据权利要求6所述的免疫细胞，其中所述抗体的抗原结合片段包括单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。


8.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和/或所述第二抗原结合结构域包括所述第一和/或第二抗原的配体。


9.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述细胞外结构域在所述第一抗原结合结构域与所述第二抗原结合结构域之间不包含接头。


10.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域通过接头连接至所述第二抗原结合结构域。


11.根据权利要求10所述的免疫细胞，其中所述接头包含与SEQIDNO:102、107、108、109或110的接头具有至少90％序列同一性的氨基酸。


12.根据权利要求2所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包括铰链/跨膜结构域。


13.根据权利要求12所述的免疫细胞，其中所述铰链/跨膜结构域包括免疫球蛋白样蛋白、CD28、CD8或4-1BB的铰链/跨膜结构域。


14.根据权利要求12所述的免疫细胞，其中所述跨膜结构域包括CD8的铰链/跨膜结构域，其任选地包含氨基酸序列SEQIDNO:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104，或与氨基酸序列SEQIDNO:4、10、16、22、28、37、46、58、66、72、78或104具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


15.根据权利要求2所述的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3θ、CD3ε、CD3η、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的细胞内信号传导结构域。


16.根据权利要求15所述的免疫细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包括CD3ζ的细胞内信号传导结构域，其任选地包含氨基酸序列SEQIDNO:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106，或与氨基酸序列SEQIDNO:6、12、18、24、30、39、48、60、68、74、80或106具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


17.根据权利要求3所述的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包括4-1BB、CD27、CD28或OX-40的共刺激结构域。


18.根据权利要求17所述的免疫细胞，其中所述共刺激结构域包括4-1BB的共刺激结构域，其任选地包含氨基酸序列SEQIDNO:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105，或与氨基酸序列SEQIDNO:5、11、17、23、29、38、47、59、67、73、79或105具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


19.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域包括IL-13Rα2结合结构域。


20.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述第二抗原结合结构域包括EGFRvIII结合结构域。


21.根据权利要求19所述的免疫细胞，其中所述IL-13Rα2结合结构域包括抗IL-13Rα2scFv或IL-13Rα2的配体。


22.根据权利要求21所述的免疫细胞，其中IL-13Rα2的所述配体包括IL-13或IL-13泽塔因子或其抗原结合片段。


23.根据权利要求19所述的免疫细胞，其中所述IL-13Rα2结合结构域包含与氨基酸序列SEQIDNO:101具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


24.根据权利要求23所述的免疫细胞，其中所述IL-13Rα2结合结构域包含氨基酸序列SEQIDNO:101。


25.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述EGFRvIII结合结构域包含抗体的抗原结合片段。


26.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述EGFRvIII结合结构域包含抗EGFRvIIIscFv。


27.根据权利要求26所述的免疫细胞，其中所述抗EGFRvIIIscFv包含含有与氨基酸序列SEQIDNO:111或113具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域(VH)，和/或含有与氨基酸序列SEQIDNO:112或114具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。


28.根据权利要求27所述的免疫细胞，其中所述VH包含氨基酸序列SEQIDNO:111或113，和/或所述VL包含氨基酸序列SEQIDNO:112或114。


29.根据权利要求20所述的免疫细胞，其中所述EGFRvIII结合结构域包含与氨基酸序列SEQIDNO:103具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


30.根据权利要求29所述的免疫细胞，其中所述EGFRvIII结合结构域包含氨基酸序列SEQIDNO:103。


31.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述CAR多肽包含与氨基酸序列SEQIDNO:100具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


32.根据权利要求31所述的免疫细胞，其中所述CAR多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:100。


33.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：
(i)CAR多肽，其包含与氨基酸序列SEQIDNO:100具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)BiTE，其中所述BiTE结合靶抗原和T细胞抗原。


34.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：
(i)CAR多肽，所述CAR多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:100；以及
(ii)BiTE，其中所述BiTE结合靶抗原和T细胞抗原。


35.根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是选自以下各项之一的胶质母细胞瘤相关抗原：EGFR、EGFRvIII、CD19、CD79b、CD37、PSMA、PSCA、IL-13Rα2、EphA1、HER2、间皮素、MUC1或MUC16。


36.根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞，其中所述T细胞抗原是CD3。


37.根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是EGFR并且所述T细胞抗原是CD3。


38.根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞，其中所述BiTE包含与氨基酸序列SEQIDNO:98或99具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


39.根据权利要求38所述的免疫细胞，其中所述BiTE包含氨基酸序列SEQIDNO:98或99。


40.根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。


41.根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人细胞。


42.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1、33或34所述的CAR多肽和BiTE。


43.根据权利要求42所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含CAR多肽编码序列和BiTE编码序列，并且其中所述CAR多肽编码序列和所述BiTE编码序列被核糖体跳跃部分分开。


44.根据权利要求42所述的多核苷酸，其中所述CAR多肽和/或所述BiTE在组成型启动子下表达。


45.根据权利要求44所述的多核苷酸，其中所述组成型启动子包括延伸因子-1α(EF1α)启动子。


46.根据权利要求42所述的多核苷酸，其中所述CAR多肽和/或所述BiTE在诱导型启动子下表达。


47.根据权利要求46所述的多核苷酸，其中所述诱导型启动子可通过T细胞受体(TCR)或CAR信号转导诱导。


48.根据权利要求47所述的多核苷酸，其中所述诱导型启动子包含激活T细胞核因子(NFAT)反应元件。


49.根据权利要求42所述的多核苷酸，其中所述CAR多肽和所述BiTE各自在组成型启动子下表达。


50.根据权利要求42所述的多核苷酸，其中所述CAR多肽在组成型启动子下表达，并且所述BiTE在诱导型启动子下表达。


51.根据权利要求42所述的多核苷酸，其进一步包含自杀基因。


52.根据权利要求42所述的多核苷酸，其进一步包含编码一个或多个信号序列的序列。


53.一种载体，所述载体包含根据权利要求42所述的多核苷酸。


54.根据权利要求53所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。


55.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞。


56.一种在需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据权利要求1、33或34所述的免疫细胞、其药物组合物。


57.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤，任选地其中所述癌症包含表达由EGFR、EGFRvIII、CD19、CD79b、CD37、PSMA、PSCA、IL-13Rα2、EphA1、HER2、间皮素、MUC1和MUC16组成的组中的一种或多种。


58.根据权利要求57所述的方法，其中所述胶质母细胞瘤包含表达由IL-13Rα2、EGFRvIII、EGFR、HER2、间皮素和EphA1组成的组中的一种或多种的细胞。


59.根据权利要求57所述的方法，其中所述胶质母细胞瘤包含具有降低的EGFRvIII表达的细胞。


60.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：
(i)包含EGFR结合结构域的CAR多肽，其中所述CAR多肽包含与氨基酸序列SEQIDNO:117具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)抗GARP骆驼科动物，其包含与氨基酸序列SEQIDNO:25具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


61.一种免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：
(i)包含EGFRvIII结合结构域的CAR多肽，其中所述CAR多肽包含与氨基酸序列SEQIDNO:115或116具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及
(ii)BiTE，其中所述BiTE结合至EGFR和CD3，所述BiTE包含与氨基酸序列SEQIDNO:98或99具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。


62.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求60所述的CAR多肽和抗GARP骆驼科动物。


63.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求61所述的CAR多肽和BiTE。


64.根据权利要求62或63所述的多核苷酸，其进一步包含自杀基因。


65.根据权利要求62或63所述的多核苷酸，其进一步包含编码一个或多个信号序列的序列。


66.一种载体，所述载体包含根据权利要求62或63所述的多核苷酸。


67.根据权利要求66所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。


68.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求60或61所述的免疫细胞。


69.一种在受试者中治疗具有降低的EGFRvIII表达的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞经工程化以表达：(i)包含细胞外EGFRvIII结合结构域的CAR多肽；和(ii)BiTE，其中所述免疫细胞任选地选自根据权利要求1、33、34、60和61中任一项所述的免疫细胞。


70.一种在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的CAR；和(ii)BiTE，其中所述免疫细胞任选地选自根据权利要求1、33、34、60和61中任一项所述的免疫细胞。


71.一种在受试者中预防或减少肿瘤微环境中的T细胞消耗的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的CAR；和(ii)BiTE，其中所述免疫细胞任选地选自根据权利要求1、33、34、60和61中任一项所述的免疫细胞。


72.一种在受试者中治疗具有异质抗原表达的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给予免疫细胞，所述免疫细胞包含(i)包含细胞外靶标结合结构域的CAR；和(ii)BiTE，其中所述免疫细胞任选地选自根据权利要求1、33、34、60和61中任一项所述的免疫细胞。


73.根据权利要求72所述的方法，其中所述癌症是胶质母细胞瘤、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、淋巴瘤或骨髓瘤。


74.根据权利要求72所述的方法，其中所述癌症包含表达由EGFR、EGFRvIII、CD19、PSMA、PSCA、IL-13Rα2、EphA1、Her2、间皮素、MUC1和MUC16组成的组中的一种或多种的细胞。


75.一种CART细胞，所述CART细胞包含异源核酸分子，其中所述异源核酸分子包含：
(a)编码CAR的第一多核苷酸，所述CAR包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域；以及
(b)编码治疗剂的第二多核苷酸。


76.根据权利要求75所述的CART细胞，其中所述治疗剂包括抗体试剂。


77.根据权利要求76所述的CART细胞，其中所述抗体试剂包括单链抗体或单结构域抗体。


78.根据权利要求76所述的CART细胞，其中所述抗体试剂包括双特异性抗体试剂。


79.根据权利要求78所述的CART细胞，其中所述双特异性抗体试剂包括BiTE。


80.根据权利要求77所述的CART细胞，其中所述单结构域抗体包括骆驼科动物抗体。


81.根据权利要求75所述的CART细胞，其中所述治疗剂包括细胞因子。


82.根据权利要求75所述的CART细胞，其中所述CAR和所述治疗剂作为分开的CAR和治疗剂分子产生。


83.根据权利要求82所述的CART细胞，其中所述CART细胞在编码所述CAR的所述第一多核苷酸与编码所述治疗剂的所述第二多核苷酸之间包含核糖体跳跃部分。


84.根据权利要求83所述的CART细胞，其中所述核糖体跳跃部分包括2A肽。


85.根据权利要求84所述的CART细胞，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·V·莫斯，B·崔，
申请(专利权)人：综合医院公司，
类型：发明
国别省市：美国;US