帕金森病的诊断标志物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及帕金森病的诊断标志物及其应用，所述诊断标志物为miR‑23b‑3p，miR‑30b‑5p，miR‑195‑5p，miR‑195‑3p，miR‑342‑3p，其序列分别如SEQ ID NO：1，2，3，4或5所示。

【技术实现步骤摘要】
帕金森病的诊断标志物及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及miR-23b-3p，miR-30b-5p，miR-195-5p，miR-195-3p，miR-342-3p，及其编码基因、生物学前体在制备帕金森诊疗试剂中的应用。
技术介绍
帕金森病(Parkinson′sdisease，PD)是一种发病率仅次于阿尔兹海默氏症的神经系统退行性疾病，以老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，目前无法治愈。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病，在临床上的具体表现为运动性症状，如静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍以及非运动性症状，如便秘、睡眠障碍、精神行为异常等。由于我国人口老龄化的加速来临，截至2014年底，我国60岁以上老年人口已经达到2.12亿，占总人口的15.5％。其中，老年神经退行性疾病，包括阿尔兹海默氏病(老年痴呆)和帕金森病，将成为困扰中国医疗系统的重大难题。据统计，我国60岁及以上人群中，帕金森病的比例为1％，而65岁以上的人群中帕金森病的比例上升到1.7％(Tianetal.，2011)。据此计算，我国仅帕金森病的患者就达到212万人，未来将达到400万人，是继肿瘤、心脑血管病之后中老年的“第三杀手”。目前，帕金森患者正趋于年轻化，青少年型帕金森病患者占总人数的10％。老年神经退行性疾病源于神经细胞的衰老退化，一般认为，帕金森病是由于病人中脑多巴胺能神经元显著丢失引起的。目前主要以药物去补充或刺激脑内不足的左旋多巴，但药物治疗存在副作用多和长期应用后药效衰减的缺点。长期用药后，脑内神经元对药物的敏感性变差，可能会出现″异动症″或是″药效波动″。除了药物的治疗之外，帕金森临床手术治疗方式主要有两种：立体定向靶点射频损毁术(细胞刀)和深部脑核团刺激术(DBS)(Malek，2019)，但均不能达到很好的疗效。当前市场上尚无任何有效的药物可以逆转神经细胞的退化过程。因此，帕金森的治疗存在药物缺乏，治疗手段单一的问题，患者的预后较差，病情仍然会继续发展，严重影响其生活质量。目前帕金森病的发病机制还不清楚，相关的影响因子包括遗传因素、线粒体功能缺陷、氧化应激、免疫异常、细胞凋亡、环境因素等(Simonetal.，2020)。研究表明，约5-10％的患者为家族型PD患者，具有明显的遗传特性，剩下的大多数为散发性PD患者(Dengetal.，2018)。当前的共识认为帕金森是环境因素和多个疾病相关基因共同作用的结果，而对帕金森致病基因及其调控机理的研究是帕金森发病机制研究的一大热点。迄今为止，研究发现与遗传性PD相关的基因包括SNCA，LRRK2，HTRA2，DJ-1，PINK-1，PLA2G6等(vanderVlagetal.，2020)。然而，针对这些帕金森病相关基因的研究还比较粗浅，无法全面揭示其致病机理，从而开发相应的治疗方案。因此，提前发现疾病，同时有针对性的按照患者自身情况制定个性化治疗方案，是帕金森临床上迫切需要解决的问题。提早发现筛查帕金森病可以最大限度提高患者的生存质量，减轻患者的痛苦，减少家庭和社会的经济负担。然而，提前诊断需要灵敏且准确的分子标记，以实现帕金森病的早期筛查和干预。另一方面，帕金森病标志物电可以作为潜在的药物研究位点，开发针对相关分子标记物的临床治疗药物。为筛选可能的帕金森病分子标记物，专利技术人通过对15例帕金森病患者及9例健康志愿者对照外周血的血浆样本进行小RNA的高通量测序，测得的差异表达小RNA再结合生物信息学方法进行比对筛选，挑选出5个帕金森病相关小RNA，包括miR-23b-3p，miR-30b-5p，miR-195-5p，miR-195-3p和miR-342-3p。进一步地，专利技术人通过实时定量PCR验证了上述小RNA在大鼠帕金森疾病模型中的表达差异性，继而在帕金森病人和健康志愿者的血浆中逐一检测了上述小RNA的表达量，从不同角度证实了其与帕金森病具有良好的相关性。因此，上述小RNA不仅可用于制备帕金森病诊断制剂，而且是潜在的药物开发靶点，具有重要的临床应用价值。1.TianYY，TangCJ，WuJ，ZhouJS.Parkinson′sdiseaseinChina.NeurolSci.2011Feb；32(1)：23-30.2.MalekN.DeepBrainStimulationinParkinson′sDisease.NeurolIndia.2019Jul-Aug；67(4)：968-978.3.SimonDK，TannerCM，BrundinP.ParkinsonDiseaseEpidemiology，Pathology，Genetics，andPathophysiology.ClinGeriatrMed.2020Feb；36(1)：1-12.4.DengH，WangP，JankovicJ.ThegeneticsofParkinsondisease.AgeingResRev.2018Mar；42：72-85.5.vanderVlagM，HavekesR，HeckmanPRA.ThecontributionofParkin，PINK1andDJ-1genestoselectiveneuronaldegenerationinParkinson′sdisease.EurJNeurosci.2020Jan28.
技术实现思路
本专利技术的目的在于筛选和开发一批具有潜在应用价值的分子标记物和治疗靶点，以供帕金森病临床诊断和制备制剂中的应用。为实现上述目的，本专利技术首先采集帕金森病人和健康志愿者的外周血，分离血浆。利用分子生物学的方法提取血浆中的小RNA，并通过高通量RNA测序结合生物信息学方法筛选到候选基因群体。随后，进一步通过生物信息学的方法筛选出一组调控帕金森病相关基因表达的小RNA，并通过实时定量PCR在大鼠帕金森模型中验证了这一组小RNA在大鼠血浆中的差异性表达，最终确定了miR-23b-3p，miR-30b-5p，miR-195-5p，miR-195-3p和miR-342-3p等5个帕金森病相关的小RNA。最后，专利技术人对上述5个小RNA在帕金森病人和健康志愿者血浆中的表达量逐一进行检测，并验证了其与帕金森病具有良好的相关性，可作为帕金森病临床诊断的分子标记，也可作为治疗靶点用于治疗帕金森制剂的制备，具有重要的临床应用价值。本专利技术解决上述技术问题的示例性技术方案如下：1.收集帕金森病人和健康志愿者的外周血6ml，通过离心分离血浆。2.利用QiagenmiRNeasySerum/PlasmaKit(CatNo./ID：217184)提取血浆中的小RNA，测定RNA的质量和浓度，确保浓度在10ng/ul以上。3.以总RNA为实验材料，首先与3’端接头相连；随后再与5’接头相连；PCR扩增，富集两端都有接头的小RNA；随后进行聚丙稀酰胺凝胶电泳，把小RNA文库与其它RNA的文库根据长度分离开，切割含有小RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.miRNA分子或其前体，所述miRNA序列分别如SEQ ID NO：1，2，3，4或5所示。/n

【技术特征摘要】
1.miRNA分子或其前体，所述miRNA序列分别如SEQIDNO：1，2，3，4或5所示。


2.权利要求1的miRNA分子或其前体在制备诊断帕金森病的药物中的应用。


3.权利要求2所述的应用，其中相比于健康受试者而言，SEQIDNO：1，2或5在受试者外周血中的表达量下降指示所述受试者为帕金森患者，SEQIDNO：3或4在受试者外周血中的表达量升高指示所述受试者为帕金森患者。


4.提高SEQIDNO：1，2或5在受试者外周血中含量的试剂在制备用于治疗帕金森病的药物中的应用或在制备降低LRRK2和/或GAK基因的表达量或升高ATP13A2，SNCA和/或UCHL1基因的表达量的药物中的应用，优选地，其中所述提高SEQIDNO：1，2和/或5在受试者外周血中含量的试剂选自用于增加SEQIDNO：1，2和/或5在受试者外周血中拷贝数的含有SEQIDNO：1，2和/或5的过表达载体，调控SEQIDNO：1，2和/或5基因表达的启动子，抑制负调控SEQIDNO：1，2和/或5基因表达的转录因子的试剂，用于干扰抑制SEQIDNO：1，2和/或5基因表达的抑制子的RNAi；抑制促进SEQIDNO：1，2和/或5mRNA降解的microRNA转录表达的试剂，或促进SEQIDNO：1，2和/或5表达的microRNA。


5.降低SEQIDNO：3或4在外周血中含量的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡萌，熊南翔，魏君，毛伟兵，朱亚莎，
申请(专利权)人：武汉睿健医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42