与Pol II和Pol III亲和力增强的H1启动子制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一组与Pol II和Pol III亲和力增强的H1启动子。本发明专利技术所提供的H1启动子能有效增强Pol II和Pol III的转录能力。

H1 promoter with enhanced affinity to Pol II and pol III

【技术实现步骤摘要】
与PolII和PolIII亲和力增强的H1启动子
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一组与PolII和PolIII亲和力增强的H1启动子。
技术介绍
真核生物中的RNA转录是由三种RNA聚合酶实现的：PolI、II和III。这些聚合酶分别包含14、12和17个亚基，并共用一个10亚基的催化核心。但是它们转录不同种类的基因的转录本。PolI转录核糖体RNA；PolII转录mRNA(编码蛋白)以及大部分的小核内RNA(snRNAs)；PolIII专一性的转录小型非编码RNA，包括5SrRNA(type1)、tRNAs(type2)以及其它必需的RNA(type3)，如U6snRNA。因此type3型的PolIII(例如7SK,U6,H1等启动子)在生物学中常用来表达小RNA，例如RNA干扰中的shRNA，基因组编辑时使用的gRNA(guideRNA)。由于H1启动子具有序列短(野生型224bp,截短型100bp)，能够同时具有PolII和PolIII启动子活性的优点，非常适合应用于病毒载体，尤其是天然承载量比较低的AAV(腺相关病毒)载体中。然而相对CMV、EF1a等较强的PolII启动子，H1的活性仍然相对比较弱。
技术实现思路
本专利技术涉及一组截短的H1启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。本专利技术还涉及H1启动子，其由如上所述的截短的H1启动子的5′端与SEQIDNO:3的3′端起的1~124个核苷酸相连得到。特别的，当所述H1启动子为如上所述的截短的H1启动子的5′端与SEQIDNO:3的全部序列的3′端相连时，可以得到SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示核酸片段。为方便表述，SEQIDNO:1~4所对应的启动子分别依次用H1s-m1、H1s-m2、H1-m1和H1-m2所指代。本专利技术还涉及基因表达盒，其包含启动子和由所述启动子所启动的DNA片段；所述DNA片段用于转录RNA聚合酶II专一性RNA和/或RNA聚合酶III专一性RNA；所述启动子为如上所述的截短的H1启动子，或如上所述的H1启动子。本专利技术还涉及载体，其包含如上所述的基因表达盒。本专利技术还涉及宿主细胞，其为含有如上所述的基因表达盒或载体的真核细胞。本专利技术还涉及一种改变真核细胞中基因产物表达的方法，包括将载体引入所述真核细胞中，所述载体包含启动子，其可操作连接至编码Ⅱ型CRISPR-Cas系统的gRNA和Cas酶的DNA片段，并用于启动所述DNA片段的转录；所述启动子为如上所述的截短的H1启动子，或如上所述的H1启动子；所述gRNA有一种或多种，其与所述基因产物对应的DNA分子的靶序列杂交；其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，所述Cas酶切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术通过文库筛选获得了H1-m1和H1-m2两种H1启动子突变体.经AAV病毒感染实验，两个突变体提高了mRNA的表达能力，H1-m1和H1-m2突变体相对野生型H1，qPCR结果显示mRNA表达水平可增强3倍以上。（2）本专利技术还证实，H1-m1和H1-m2两个突变型启动子的截短体H1s-m1和H1s-m2提高了mRNA的表达能力，H1s-m1和H1s-m2相对野生型H1，qPCR结果显示mRNA表达水平可增强1.4倍以上。（3）另本专利技术还证实，H1-m1和H1-m2两个突变型启动子以及其对应的截短型H1s-m1和H1s-m2的PolIII转录能力也明显高于H1野生型启动子，且所启动的CRISPR系统的切割活性也明显升高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中pSLenti-H1-BsmBI-EGFP-WPRE的载体图谱；图2为本专利技术一个实施例中pAAV-H1-EGFP-WPRE-PolyA的载体图谱；图3为本专利技术一个实施例中pAAV-H1-m1-EGFP-WPRE-PolyA的载体图谱；图4为本专利技术一个实施例中pAAV-H1-m2-EGFP-WPRE-PolyA的载体图谱；图5为本专利技术一个实施例中pAAV-H1s-EGFP-WPRE-PolyA的载体图谱；图6为本专利技术一个实施例中pAAV-H1s-m1-EGFP-WPRE-PolyA的载体图谱；图7为本专利技术一个实施例中pAAV-H1s-m2-EGFP-WPRE-PolyA的载体图谱；图8为本专利技术一个实施例中病毒感染293T荧光图；图9为本专利技术一个实施例中H1突变体相对于野生型H1表达强度；图10为本专利技术一个实施例中pAAV-H1-gRNA-AAVS1-spCas9-pA的载体图谱；图11为本专利技术一个实施例中pAAV-H1-m1-gRNA-AAVS1-spCas9-pA的载体图谱；图12为本专利技术一个实施例中pAAV-H1-m2-gRNA-AAVS1-spCas9-pA的载体图谱；图13为本专利技术一个实施例中pAAV-H1s-gRNA-AAVS1-spCas9-pA的载体图谱；图14为本专利技术一个实施例中pAAV-H1s-m1-gRNA-AAVS1-spCas9-pA的载体图谱；图15为本专利技术一个实施例中pAAV-H1s-m2-gRNA-AAVS1-spCas9-pA的载体图谱；图16为本专利技术一个实施例中病毒感染后检测SpCas9表达图；图17为本专利技术一个实施例中AAVS1gRNA表达图；图18为本专利技术一个实施例中T7E1酶切活性鉴定电泳图；图19为本专利技术一个实施例中切割活性鉴定的灰度分析图。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本专利技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本专利技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本专利技术更广阔的方面。本专利技术通过文库筛选，获得与PolII和PolIII亲和力增强的H1启动子（SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示），其能有效增强PolII和PolIII的转录能力。由此可见，所述H1启动子尤其适用于需要同时在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.截短的H1启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.截短的H1启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。


2.H1启动子，其特征在于，由权利要求1所述的截短的H1启动子的5′端与SEQIDNO:3的3′端起的1~124个核苷酸相连得到。


3.根据权利要求2所述的H1启动子，其特征在于，核苷酸序列为SEQIDNO:4或SEQIDNO:5所示。


4.基因表达盒，其特征在于，包含启动子和由所述启动子所启动的DNA片段；
所述DNA片段用于转录RNA聚合酶II专一性RNA和/或RNA聚合酶III专一性RNA；
所述启动子为权利要求1所述的截短的H1启动子，或权利要求2或3所述的H1启动子。


5.根据权利要求4所述的基因表达盒，其特征在于，所述RNA聚合酶II专一性RNA为mRNA和/或snRNA。


6.根据权利要求5所述的基因表达盒，其特征在于，所述mRNA用于表达Cas酶。


7.根据权利要求6所述的基因表达盒，其特征在于，所述Cas酶是Cas9。


8.根据权利要求4~7任一项所述的基因表达盒，其特征在于，所述RNA聚合酶III专一性RNA为5SrRNA、tRNA、shRNA、miRNA、gRNA、crRNA、tracrRNA和snRNA中的至少一种。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兴林，贾国栋，杨佳丽，詹霞，高花，
申请(专利权)人：和元生物技术上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31