一系列可阻断IL-6的多肽制造技术

本发明专利技术描述了一系列创新的可抑制ＩＬ－６的优化多肽蛋白，它们具有高度的生物活性、优异的稳定性、和良好的体内半衰期，可以在体内外高效结合ＩＬ－６，从而阻断ＩＬ－６的生物作用，可用于治疗多种癌症和自身免疫性疾病，也可用于针对ＩＬ－６的诊断试剂；本发明专利技术包括这些能抑制ＩＬ－６的优化多肽蛋白、及其编码重组ＤＮＡ序列和表达载体、该重组蛋白的药物用途、含有该重组蛋白的药物及其制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程
，具体地说，涉及编码可结合IL-6并阻断其信号的创新多肽的DNA序列、其所编码的多肽蛋白、该多肽在医疗药物和诊断试剂上的应用。
技术介绍
白细胞介素-6(Interleukin-6，简称为IL-6)是一种多功能的调节免疫和炎症反应的细胞因子，而且在很多人体疾病中起重要作用，包括各种感染、炎症、自身免疫性疾病、和多种癌症(Ishihara et al，Cytokine Growth Review，2002，13357-368)。人体内IL-6的主要来源是单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞，同时T细胞、B细胞、角质细胞、肾系膜细胞、和多种肿瘤细胞也都可以生成IL-6。IL-6的生理作用非常复杂，对B细胞、T细胞、骨髓干细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、蚀骨细胞等多种细胞的生长、分化、和成熟起重要的调节作用，同时对炎症反应在不同的条件下可以有促进、或抑制的作用。IL-6的促炎反应和别的促炎因了(如TNFα和IL-1)类似，可以引起发烧和急性期蛋白质(Acute phase protein)的生成，包括血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A)、C反应蛋白(C-reactiveprotein)、α1抗胰蛋白酶(α1 antitrypsin)、纤维酶原(Fibronogen)、触珠蛋白(Haptoglobulin)等，而IL-6抑制炎症反应的作用则是通过抑制促炎因了TNFα和IL-1的生成来达到的。多项研究表明，IL-6的浓度在多种癌症、自身免疫性疾病、和其他疾病患者体内出现异常升高，而且IL-6的作用和这些疾病的症状程度有直接关系，因此阻断IL-6的作用是尝试治疗这些疾病的当然选择(Trikha et al，Clinical CancerResearch，2003，94653-4665)。IL-6的生物作用是通过和细胞膜表面的受体相结合，引发受体活化，从而把IL-6的信号由细胞外传递到细胞内。IL-6的受体是由二种蛋白IL-6R和GP130组成的二聚体，阻断IL-6信号传递的最有效方法是抑制IL-6与其受体的结合。目前已经有多种阻断IL-6或IL-6受体的抑制剂正在欧美进行癌症和多种自身免疫性疾病的临床试验，包括类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis)、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus)、克隆病(Crohn’sDisease)、幼年型特发性关节炎(Juvenile idiopathic arthritis)等，而且日本在2005年已经批准了一个针对IL-6受体的单克隆抗体新药Actemra以用于治疗Castleman病(一种罕见的淋巴增殖性疾病)，因此开发阻断IL-6的抑制剂在医疗应用上拥有重要意义。研究表明，一个氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述的重组多肽M123可以在体外有效地结合IL-6(Silverman et al，Nature Biotechnology，2005，23(12)1556-1561)，但该多肽的生物活性和在人体内的稳定性均不足以满足医疗应用的需要，因此不能直接用于临床。本专利技术对此多肽进行了改良，设计并建造了一系列的优化多肽，从而大大增加了其在体内外的稳定性和生物活性，并且具有更长的血清半衰期，从而能够在人体内更有效地中和IL-6，达到更好的抑制炎症反应的治疗效果。本专利技术提供了三种不同的策略对M123进行了优化改良，分别得到了更加适合医疗应用的优化多肽。第一，M123是个相对较小的多肽，只有共122个氨基酸，分子量为13.3kD，其在人体内血液中的半衰期预计很短。一种已知的延长M123体内半衰期的方法是将其连接一个多肽IG形成融合蛋白C326，IG的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述(Silverman et al，Nature Biotechnology，2005，23(12)1556-1561)，由于IG具有结合人体免疫球蛋白的功能，因此可以大大提高C326在血液中的半衰期。因为融合蛋白C326中的M123和IG是二个完全不同的功能区域，各自必须具备稳定的结构才能保证该融合蛋白具有最佳的结构稳定性和生物活性，而C326中连接M123和IG的肽链SAPASEPPGSL没有经过优化选择，不能够保证M123和IG形成最佳的稳定结构，从而使得C326不具备最佳的稳定结构。为了提供一个包含IG和M123的最佳融合蛋白，本专利技术设计并建造了一个弹性结构的优化肽连接段G9连接于IG和M123之间，G9的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.3所述，由于G9高度的结构弹性和可塑性，该融合蛋白具有优异的结构稳定性和生物活性，显著增加了其对IL-6的亲和力，大大提高了其医疗应用性。第二，对蛋白质和多肽进行聚乙二醇修饰(PEGylation)是一种延长药物血清半衰期、及降低其免疫反应的有效方法(Harris et al，Nature Reviews DrugDiscovery，2003，2(3)214-221)，其中常用的化学修饰方法是将聚乙二醇和多肽中唯一的一个自由的胱氨酸(Cystine)相结合，从而可以得到一个只在特定位置联接一个聚乙二醇分子的单一多肽分子。M123本身不包含自由的胱氨酸，因此本专利技术将人免疫球蛋白IgG1中的铰链(hinge region)N-端包含第一个胱氨酸的短肽链Hn，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所述，连接到M123的C-端，得到了一个包含M123和一个自由胱氨酸的多肽，从而可以在聚乙二醇修饰后进行医疗应用。第三，利用人免疫球蛋白Fc区域形成融合蛋白是一种已经被证明行之有效的医疗应用多肽的策略，不但可以通过Fc区域二聚化提高其生物活性，而且因为免疫球蛋白血液中通常高达3星期的半衰期，大大延长该融合蛋白的血清半衰期(Chamow SM and Ashkenazi A，Antibody Fusion Proteins，1999，Wiley-Liss)。本专利技术将M123和人免疫球蛋白Fc形成了一个融合蛋白，并且在M123和Fc之间插入了一个弹性结构的优化肽连接段G9，该融合蛋白在哺乳动物细胞系统表达后二聚化，大大提高了对IL-6的亲和力，可达到更佳的治疗效果。由此，本专利技术描述了一系列创新的可抑制IL-6的优化多肽蛋白，它们可以在体内外高效结合IL-6，从而阻断IL-6的生物作用，可用于治疗多种癌症和自身免疫性疾病，也可用于针对IL-6的诊断试剂。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一系列全新的可结合IL-6的优化多肽蛋白，其在体内外都具有优良的稳定性和生物活性，并能阻断IL-6信号传递，从而抑制炎症的发展。本专利技术目的之二是提供编码所述多肽的核苷酸序列。本专利技术目的之三是提供含有编码所述多肽的核苷酸序列，其表达载体和由该载体转化的重组体，以及表达细胞。本专利技术目的之四是提供该多肽作为抗炎药物在治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中的应用，还有包含上述多肽及可药用载体的药物组合物及其在治疗相关疾病中的应用。本专利技术目的之五是提供该多肽作为针对IL-6的诊断试剂。本专利技术描述的优化的融合蛋白质是通过常规的基因重组技术所建造，具体实验步骤如《分子克隆》第三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白质，由可结合人免疫球蛋白的多肽ＩＧ和可结合ＩＬ－６的多肽Ｍ１２３构成，ＩＧ和Ｍ１２３之间由一个优化肽连接段相连，该肽连接段选自以下组：ａ．ＧｌｙＧｌｙ　ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ Ｇｌｙ，表示为Ｇ９；ｂ．任何一个长度为４到３０的氨基酸序列，其具有弹性结构并能增加融合蛋白的结构稳定性和生物活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余波，郑佳，
申请(专利权)人：余波，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]