用于产生巨核细胞的组合物和方法技术

提供了由干细胞产生巨核细胞祖细胞(前MK)和巨核细胞(MK)的方法。本公开进一步提供了包含前MK和MK及其裂解物的组合物，以及使用前MK、MK、其裂解物及其组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生巨核细胞的组合物和方法政府支持声明本工作得到了美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)下述资助号的资助：1R44HL131050-01、1R43AI125134-01A1和1SB1HL137591-01。政府对本专利技术享有某些权利。相关申请本申请要求2018年1月5日提交的美国临时申请序列号62/614,117的权益和优先权，通过引用其全部内容纳入本文。
本公开涉及产生巨核细胞祖细胞和巨核细胞的方法，具有巨核细胞祖细胞和巨核细胞的组合物及其用途。背景血小板是负责活动性出血部位血块形成和血管修复的血液细胞。生理学角度而言，血小板由称之为巨核细胞(MK)的亲本细胞在骨髓中产生，所述MK占骨髓中细胞的<0.1％。成熟的MK位于骨髓中的窦状血管(sinusoidalbloodvessel)外，并将称为前血小板(proplatelet)的长结构扩展到循环系统中。前血小板作为血小板产生的组装线，并从其末端依次释放血小板。MK是由造血干细胞通过多步骤分化过程在骨髓中产生的。暴露于各种细胞因子、趋化因子和生长因子(包括促血小板生成素)导致造血干细胞分化成多能祖细胞，然后分化成定型的巨核细胞祖细胞，也称之为前MK。经过进一步分化，包括细胞扩大、DNA含量增加、核内有丝分裂和颗粒形成，产生了成熟MK。MK将其细胞团转化成前血小板伸展(extension)以产生/释放无核血小板。血小板计数低是多种疾病和疗法(包括癌症治疗、移植和手术)的显著后果，对于这些疾病和疗法，血小板是防止由于失控出血而导致的死亡的关键一线疗法。血小板单位(3x10^11血小板/200-400mL)完全来自人志愿者供体并且必须保存在室温下以避免不可逆的活化。然而，在该温度下，存在细菌生长的风险，这将血小板单位的保存期限限制为5天，其中2天被病原体筛选消耗并且1天被运输消耗。因此，血液中心通常没有超过1.5天的血小板库存可用于输血，这在紧急情况下会迅速耗尽。可能会出现血小板供体短缺，尤其是在关键时刻。仅民用需求的不断增加就超过供应量约20％，并且在紧急情况下库存将迅速耗尽。此外，单位和供体之间广泛的功能差异导致过度输血以确保有效的出血控制。因此，迫切需要提供血小板来源的巨核细胞，以及产生巨核细胞的新型、改进方法。
技术实现思路
本公开提供了由干细胞产生巨核细胞祖细胞(前MK)和巨核细胞(MK)的方法。本公开进一步提供了包含前MK和MK及其裂解物的组合物，以及使用前MK、MK、其裂解物及其组合物的方法。在一些实施方式中，本公开提供了用于产生巨核细胞的方法，其包括：在低粘附或非粘附条件下并在搅拌下扩增多能干细胞，其中扩增的多能干细胞形成自聚集球状体；在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；在第二培养基中将造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞。将多能细胞分化成造血内皮细胞是在粘附条件下于基质上进行的。在一些实施方式中，将多能细胞分化成造血内皮细胞是在低粘附或非粘附条件下进行的，以使得造血内皮细胞能够自聚集。在一些实施方式中，本公开提供了用于产生巨核细胞的方法，其包括：在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；和在第二培养基中将造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞，其中分化多能细胞和分化造血内皮细胞中的至少一项是在基质涂覆的三维结构上进行的。三维结构可以是微运载体或微运载体。在一些实施方式中，本公开提供了用于产生巨核细胞的方法，其包括：在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；和在第二培养基中将造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞，其中分化多能细胞和分化造血内皮细胞中的至少一项是在低粘附或非粘附条件下进行的，以使得造血内皮细胞能够自聚集。在一些实施方式中，第一培养基包含骨形态发生蛋白4(BMP4)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种。第一培养基可以包括WNT调节剂。在一些实施方式中，第二培养基包含干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)和肝素中的一种或多种。在一些实施方式中，多能干细胞是人诱导型多能干细胞。在一些实施方式中，本方法还包括在基质包被的三维结构上扩增多能干细胞的步骤。在一些实施方式中，本方法可以还包括在第三培养基中将巨核细胞祖细胞分化成巨核细胞的步骤。第三培养基可以包含干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)、白介素9(IL-9)和肝素中的一种或多种。在一些实施方式中，本公开提供了具有通过本公开的方法产生的巨核细胞祖细胞或巨核细胞祖细胞的裂解物的组合物。在一些实施方式中，本公开提供了由本公开方法产生的巨核细胞或巨核细胞的裂解物。在一些实施方式中，这类巨核细胞为CD42b+、CD61+和DNA+。由下文描述和权利要求中能够很容易地了解本公开的其他特征和优点。附图简要说明本公开将在参照所提及的附图通过示例性实施方式的非限制性实例详细描述(其中类似的参照数字代表了附图的几个视图的相似部分)，并且其中：图1显示了用于由iPSC系大规模分化巨核细胞祖细胞(前MK)、巨核细胞(MK)和血小板(PLT)的总体示意图。图2描述了2D基质依赖型系统如细胞培养板或培养瓶中多能干细胞向多核细胞的定向分化方案的示例。图3A和图3B描述了3种示例性临床级hiPSC系(在此称之为PBG1、PBG2、PBG3)的多能性。图3A描绘了在具有Essential8培养基的玻连蛋白(Vitronectin)基质上培养时PBG1、PBG2和PBG3iPSC形成特征生长区域的低放大倍数相衬(phasecontrast)图像。图3B描述了针对多能性因子Oct4和Nanog进行免疫染色并用核染料复染色的PBG1、PBG2和PBG3iPSC的更大放大倍数图像。图4A、图4B、图4C和图4D描述了PBG1、PBG2和PBG3iPSC的培养，其经历由多能干细胞到成熟巨核细胞的定向分化的阶段。图4A描述了定向分化过程的一般时间线示意图。图4B显示了在阶段0(第0天)、阶段I(第2天和第5天)、阶段II(第6+7天)和阶段III(第+2和+4天)期间的PBG1培养的实际图像。图4C显示了在阶段0(第0天)、阶段I(第2天和第5天)、阶段II(第6+7天)和阶段III(第+2和+4天)期间的PBG2培养的实际图像。图4D显示了在阶段0(第0天)、阶段I(第2天和第5天)、阶段II(第6+7天)和阶段III(第+2和+4天)期间的PBG3培养的实际图像。图5是描述在阶段I结束时PBG1、PBG2和PBG3iPSC系定向分化的平均CD31+分化效率的图。图6A、图6B和图6C显示了在PBG1、PBG2和PBG3iPSC系定向分化第II阶段期间产生的巨核细胞祖细胞(CD43+CD41+)的纯度和产率。图6A描述了在第6+6天由第II阶段培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生巨核细胞的方法，其包括：/n在低粘附或非粘附条件下并在搅拌下扩增多能干细胞，其中扩增的多能干细胞形成自聚集球状体；/n在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；/n在第二培养基中将所述造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180105 US 62/614,1171.一种用于产生巨核细胞的方法，其包括：
在低粘附或非粘附条件下并在搅拌下扩增多能干细胞，其中扩增的多能干细胞形成自聚集球状体；
在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；
在第二培养基中将所述造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞。


2.如权利要求1所述的方法，其中，将所述多能细胞分化成造血内皮细胞是在粘附条件下于基质上进行的。


3.如权利要求2所述的方法，其中，所述基质包括层粘连蛋白。


4.如权利要求2所述的方法，其中，所述基质与二维表面附连。


5.如权利要求2所述的方法，其中，所述基质与三维结构附连。


6.如权利要求1所述的方法，其中，将所述多能细胞分化成造血内皮细胞是在低粘附或非粘附条件下进行的，以使得所述造血内皮细胞能够自聚集。


7.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一培养基包含骨形态发生蛋白4(BMP4)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种。


8.如权利要求7所述的方法，其中，所述第一培养基还包含WNT调节剂。


9.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二培养基包含干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)和肝素中的一种或多种。


10.如权利要求1所述的方法，其中，所述多能干细胞是人诱导型多能干细胞。


11.如权利要求1所述的方法，还包括收获和解离扩增的多能干细胞的步骤。


12.如权利要求1所述的方法，还包括在将所述巨核细胞祖细胞分化成巨核细胞之前将所述巨核细胞祖细胞接种到培养基中的非粘附表面上的步骤。


13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，还包括在第三培养基中将所述巨核细胞祖细胞分化成巨核细胞的步骤。


14.如权利要求13所述的方法，其中，所述第三培养基包含干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、白介素-6(IL-6)、白介素9(IL-9)和肝素中的一种或多种。


15.一种用于产生巨核细胞的方法，其包括：
在第一培养基中将多能细胞分化成造血内皮细胞；和
在第二培养基中将所述造血内皮细胞分化成巨核细胞祖细胞，
其中所述分化多能细胞和所述分化造血内皮细胞中的至少一项是在基质包被的三维结构上进行的。


16.如权利要求15所述的方法，其中，所述三维结构是微运载体。


17.如权利要求15所述的方法，其中，所述三维结构是微运载体。


18.如权利要求15所述的方法，其中，所述基质包括层粘连蛋白。


19.如权利要求15所述的方法，其中，所述第一培养基包含骨形态发生蛋白4(BMP4)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)中的一种或多种。


20.如权利要求15所述的方法，其中，所述第一培养基还包含WNT调节剂。


21.如权利要求15所述的方法，其中，所述第二培养基包含干细胞因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)和肝素中的一种或多种。


22.如权利要求15所述的方法，其中，所述多能干细胞是人诱导型多能干细胞。


23.如权利要求15所述的方法，还包括在所述基质包被的三维结构上扩增多能干细胞。


24.如权利要求15-23中任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·索恩，B·戴克斯特拉，
申请(专利权)人：血小板生源说股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US