稳定的冻干哺乳动物细胞的制备方法技术

一种冻干哺乳动物细胞，以产生保藏的人细胞、杂交瘤细胞、组织细胞及免疫检测和其它血液学检验所需之对照细胞的方法。在冷冻和冻干之前，将已制备的哺乳动物细胞沉淀团块悬浮于以特定最适浓度制成的海藻糖等渗溶液内，并于室温下保温一定时间。当重新水化后，冻干的细胞保留了其适于用作分析对照的最佳生理学特性，并可在于２－８℃下储存超过５个月之后仍然保留上述特性。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
一般地讲，本专利技术涉及冻干生物学材料的技术，更具体地讲涉及冻干哺乳动物细胞以制备可储存的人体细胞、杂交瘤细胞系、组织细胞以及用于免疫检测及其它血液学分析之对照细胞的新方法，所有这些冻干细胞均具有良好的稳定性和长储存寿命，而且与新鲜细胞相比，其基本上具有等同的生理学参数。冻干储存含有生物学活性分子的脂质体及细菌培养物的方法是已知的。用冻干方法制作药物片剂也是已知的。美国专利4678812公开了一种使用海藻糖化赋形剂和稳定剂制备诊断用药片的方法。美国专利4712310则描述了一种制备在诊断检测中用作试剂和稳定剂制备诊断用药片的方法。美国专利4712310则描述了一种制备在诊断检测中用作试剂载体的片剂的方法。现有专利已描述过在脂质体内包裹药物、核酸、蛋白质、指示分子(reportermolecules)、酶等材料的方法。这类专利有如美国专利4515736和4411894。美国专利3261761、4206200和4246349则介绍了冻干细菌的方法。1988年3月16日公开的欧州专利申请0259739涉及同一研究领域，其题目为“改善冻干培养物的稳定性”。同类现有技术提到糖在冻干应用中具有稳定功能。上面提到的海藻糖也具有这种功能。1986年7月17日公开的国际专利申请(PCT)WO86/03938号中公开了在冷冻干燥期间使用海藻糖在脂质体内和脂质体外(溶液中)作为保护剂的方法。在脂质体内或脂质体外使用海藻糖是已引起注意的优选方法。已述及的现有技术均未涉及保存哺乳动物细胞，特别是人体细胞。人细胞如血液细胞的膜结构不同于细菌或脂质体的膜结构。就细菌来说，其细胞壁是很厚的非脂质壁，其作用在于保护细胞的液体内容物免受热、渗透压改变及在无保护剂(如糖)存在时进行冷冻干燥所引起的不利影响。因为有很坚实的细胞壁，所以许多细菌菌株都能在没有某一种储存保护剂或被包裹的情况下耐受冷冻和干燥的冲击。就脂质体来说，其液体内容物被单层或多层脂质囊泡包围。囊泡的壁是由一种或多种有极性头部和非极性尾部之脂质成分的一层生物分子形成的。在水溶液中，排成一层的极性头部朝向周围介质，而脂质分子的非极性部分则彼此相互联接，从而在囊泡的壁中形成了一个极性表面和一种非极性核心。单层脂质体只有一层生物分子，而多层脂质体一般有许多基本上同轴心的生物分子层。因此，当将含有或不含类固醇的磷脂混合物于水溶液中分散时，即可形成一圆形的微球结构。可以想象用其包裹某种试剂，就能在体内以识别的方式运送到某一部位。脂质体囊壁是与人细胞差不多的人造双脂质膜，不过人细胞膜的组成要复杂得多。除了双脂质膜结构外，人细胞膜还有许多嵌入其脂质双层内的额外的蛋白和糖蛋白分子。特别领人感兴趣的是这些蛋白质分子提供了人造脂质体所没有的细胞表面抗原或决定基位点。人细胞表面标志的研究是进行免疫检测及它与人血液细胞有关之血液学检测的关键课题。在使用杂交瘤细胞系和单克隆抗体时，显然脂质体也存在同样差异。另外，还应考虑到哺乳动物细胞的复杂液体内容物与脂质体内容物之间的差异。在人血细胞的例子中，细胞只能存在于等渗透压液体介质中，而脂质体则可能存在于任何介质，包括非等渗溶液内。本专利技术的冻干方法是独特的，其中哺乳动物细胞可在没有对细胞形态造成不利改变的情况下被冷干，而且当用于检测试验，如用作对照细胞时在与探针或标志物结合后不会使细胞膜成为可通透的。另外，所说的冻干可以稳定细胞膜的蛋白质结构及其在细胞壁内的定向性质，这样便不会使膜表面蛋白标志受到破坏。考虑到哺乳动物细胞的细胞膜的已知的脆弱特性，相信用本专利技术冻干方法所获得的结果是出乎预料的，就冻干的哺乳动物细胞的稳定性和储存寿命来说也是令人意想不到的，而且在其重新水化之后所保留的生理学功能特性可与新鲜细胞相比拟。在实施本专利技术的方法时，作为保藏或保护性被膜包裹，只能是在哺乳动物细胞的外表面上。包裹细胞膜的内表面则是不可能作到的。所能达到的极好稳定性及长储存寿命，使得本专利技术的方法有不能应用于制备进行免疫学检测的对照细胞、在哺乳动物细胞的流式细胞计分析、血细胞计数、按大小分类及分析血细胞成分的亚群(如红细胞和白细胞)，以及各种类型细胞的DNA分析中提供适用的样品制剂。因此，各种类型的细胞均可冻干并在其后重新水化成为适于进行生物学细胞分析的样品。StefiWeisburd在“脱水并不造成死亡”(DeathDefyingDehydration)一文(ScienceNews，Vol.133，No.7，pp.97-112，February13，1988)中描述了使用国际专利申请(PCT)WO86/03938号中所述的海藻糖冷冻干燥脂质体的方法。该文献所述的研究工作是用微生物进行的，其表明海藻糖(一种低分子量糖)是在这些微生物中当它们脱水后以高浓度产生的。一般认为海藻糖可起脂质稳定剂的作用，用以增加人造细胞膜或脂质体的稳定性。该文献提请注意海藻糖并不是在所有情况下都是有用的添加物，并且应该注意海藻糖的毒理学。必须有精确而可靠的对照物以便在检测对照和样品的同时能了解准备样品的合适技术和实验室检测设备的功能，这种要求是持续的。在流式细胞计分析中，除用于构成流式细胞计工作参数的荧光素小珠或微球外，并没有可利用的确定对照组。最适合需要的对照物质应是可作为所用试剂及适当仪器功能有关的样品准备技术对照者。因此，在进行流式细胞计分析时，保存的表达必要抗原决定基或决定簇的哺乳动物细胞与试验样品的细胞一起检测，将提供一种最适对照物。可将先前测定的对照细胞的数值与研究人员测得的试验结果相比较。对所有有表面抗原的细胞进行流式细胞计分析的特点需要建立一种制备对照细胞的方法，以便维持细胞的光散射图型和膜的完整性，使被研究的细胞表面抗原的损伤降至最小程度。最好应是使用具有待研究之已知性质的新鲜细胞的基础上比较这些因素。然而，从商品供应角度看，在实验室环境中运送和储存新鲜对照细胞是不切实际的。为此，使用冻干等方法保存的哺乳动物细胞可便于运送，能够储存足够长的时间，并能在使用时重新恢复冻干前状态或重新水化，同时保留其必要的特性，这样即可为进行流式细胞计分析提供合乎需要的对照。这种冻干的哺乳动物对照细胞也应适于使用血液学分析装置，如Coulter Electronics公司(Hialeah，Florida;为Coulter公司的子公司)出售的COULTER COUNTER 血细胞。申请人确信由于几方面的原因而一直没有成功地冻干用作对照物的哺乳动物细胞。例如，冷冻条件会对这些细胞中的蛋白质分子产生有害影响，并可破坏所有膜的完整性。它使用各种糖类结合DMSO或甘油进行了抵削细胞内冷冻之不利影响的实验工作。另外还作了在冻干过程单独使用糖的实验，其中在对悬浮细胞进行冷冻和冻干时将糖加至冻干载体溶液，如标准的正常羊血清中。试验了含有或不含DMSO、磷酸盐缓冲的白蛋白(PBA)、胎牛血清，人AB型血清及正常羊血清的糖的各种浓度的溶液。使用蔗糖、牛磺酸和葡萄糖，以及DMSO与糖作为载体进行实验，所得结果均不能令人满意。例如当使用果糖时，相对于新鲜细胞之某些抗原的特异性荧光的减少，超过允许范围的光散射及特异的荧光特性等情况都会出现。使用这些糖处理细胞仍不能得到令人满意的冻干细胞，即不能制得冷冻期间免受明显损伤的本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够在水中重新水化的冻干的哺乳动物细胞，用流式细胞计光散射分析法可证实其保留了与相应新鲜细胞相似的结构完整性及细胞表面抗原性，而且作为冻干细胞在其于２至８摄氏度储存几个月后仍显示其长时间的稳定性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特H雷纳，史蒂文F小希利，肯尼思H科特莱特，
申请(专利权)人：库尔特国际公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]