抗吗啡单克隆抗体及其制备、吗啡的检测药盒及检测方法技术

公开了一种由小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合所得到的杂交瘤细胞株产生的抗吗啡单克隆抗体，特征在于该抗体不与可待因反应，但与吗啡有高度特异的反应活性；一种制备抗吗啡单克隆抗体的方法，其包括培养上述杂交瘤细胞株；一种主要包含（ａ）携带与吗啡和去甲吗啡有高度特异免疫反应活性之抗体的载体，及（ｂ）携带去甲吗啡的载体的吗啡检测药盒；及一种检测去甲吗啡的方法。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及与止痛药吗啡有高度反应活性的单克隆抗体，制备该单克隆抗体的方法及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术还涉及吗啡的检测药盒及检测的方法。近年来，用于治疗晚期肿瘤的方法之一是使用吗啡以减轻病人的疼痛。按照这种方法，如果给药剂量太小，将不会产生镇痛效果，但如果剂量太大，又可能造成很大的付作用。因此，为了确定维持足够浓度的给药剂量，必须建立一种方法以简单而迅速地监测血液中吗啡的水平。目前已知的一种简单方法是使用多克隆抗体(Spector及Parker，Science，168，1347-1348，1970;Catlin等，Clinical Chemistry，19，2，216-220，1973;Gintzler等，European Journal of Pharmacology，38，149-156，1976;及Findlay等，Research Communications in Chemical Phathology and Pharmacology，17，4，595-603，1977)或单克隆抗体(Glasel等，Molecular Immunology，20，12，1419-1422，1983;和Sawada等，Molecular Immunology，25，9，937-943，1988)的放射免疫检测法。然而，因为用于这些方法的大部分多克隆和两种单克隆抗体均与可待因(镇咳药)有交叉反应性，所以此前还没有一种当血中存在可待因时，仍然与吗啡有很高的特异反应性因而能准确检测血中吗啡水平，又与可待因无反应性的单克隆抗体。另外，当检测很大量的样品时，这些检测方法需要花费相当长的时间，而且检测程序也十分繁复。因此有必要进一步改进上述检测方法，以简便而迅速地检测血中吗啡含量。本专利技术的一个目的是提供一种与镇痛药吗啡有高度特异反应活性的单克隆抗体，其制备方法及用以产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术的另一个目的提供一种检测药盒，其主要包含一种其上面携带与吗啡及去甲吗啡有高度特异之免疫反应活性的载体及一种携带去甲吗啡的载体;以及使用该检测药盒检测吗啡的方法。为了解决上述问题，本专利技术人曾进行了广泛的研究，结果通过融合小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞得到了一株杂交瘤细胞，并经培养该杂交瘤细胞株制得一种与吗啡有高度特异反应活性的单克隆抗体，从而完成了本专利技术。本专利技术人进一步发现，使用本专利技术的检测药盒检测吗啡含量，要比现有技术中使用的检测方法更为简便而且迅速。更具体地说，本专利技术涉及一种抗吗啡单克隆抗体，其特征在于这种以小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合制得之杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体与吗啡有高度特异反应活性，但与可待因则基本上不发生反应。另外，本专利技术涉及一种制备抗吗啡单克隆抗体的方法，该方法包括培养上述杂交瘤细胞株。再者，本专利技术涉及上述的杂交瘤细胞株。第四，本专利技术涉及用于检测吗啡的药盒，其主要包含(a)一种在上面携带与吗啡和去甲吗啡具有高度特异反应活性之抗体的载体;及(b)一种其上面载有去甲吗啡的载体。第五，本专利技术涉及一种检测吗啡的方法，该方法包括使样品中的吗啡和载体上携带的去甲吗啡与携带于载体上的抗体发生竞争性反应。第六，本专利技术涉及一种检测吗啡的方法，它包括将固定在一种固相支持物上的去甲吗啡结合大分子蛋白以及待检样品中的吗啡与一种试剂完全反应，该试剂包括一种对酶标吗啡具有高度特异的免疫反应活性的单克隆抗体。本专利技术涉及的第七个方面是一种用于检测吗啡的检测盒，它主要包括(a)去甲吗啡结合大分子蛋白;(b)一种试剂，它包括对酶标记的吗啡具有高度特异免疫反应性的单克隆抗体。附图说明图1显示了利用“酶标记抗体”制作的吗啡标准曲线，图2显示了由ELISA法和HPLC法所测得的试验结果的相互关系。有关本专利技术的细节现描述如下。本专利技术的单克隆抗体是由小鼠淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤细胞株产生的，该单克隆抗体与吗啡有高度特异的反应活性。对用于本专利技术的小鼠淋巴细胞并无特殊限制，条件是它与小鼠骨髓瘤细胞融合后所得到的杂交瘤细胞株能产生与吗啡有高度特异反应活性的单克隆抗体，但最好是使用经以适当免疫原免疫后得到的淋巴细胞。作为本专利技术中用于免疫小鼠的适当免疫原也没有特殊限制，可以使用任何一种能制得与吗啡有高度特异反应活性之单克隆抗体的免疫原，如吗啡、吗啡的盐、与分子量为10，000或10，000以上之大分子载体结合的吗啡、去甲吗啡、与分子量为10，000或10，000以上之大分子载体结合的去甲吗啡等，最好使用与分子量为10，000或10，000以上之大分子载体结合的去甲吗啡。作为分子量在10，000或10，000以上的大分子载体，如可使用牛血清蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、钥孔 血兰蛋白(KLH)、免疫球蛋白等生物大分子化合物，以及多聚L-赖氨酸(PLL)等多聚氨基酸。本专利技术的具有与吗啡高度特异反应的单克隆抗体与吗啡有高度特异的反应活性，但与可卡因、可待因、二氢可待因、乙基吗啡、芬太尼、美沙酮、M-3-G(吗啡-3-葡糖酸苷)等则基本上没有反应活性。可使用淋巴细胞培养基在培养瓶内静止培养MO-2(FERM-P No.1910)、MO-3(FERM-PNo.1911)、MO-4、MO-5(FERM-P No.1912)、MO-6等细胞株得到具有这种特异性的单克隆抗体，上述细胞株是用结合到生物大分子免疫球蛋白上的去甲吗啡作为免疫原免疫过的小鼠得到的小鼠淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合而获得的杂交瘤细胞株。另外，如需要与M-6-G(吗啡-6-葡糖酸苷)基本上无反应活性的单克隆抗体时，可通过培养MO-3、MO-4、MO-5或MO-6细胞株得到具有更高特异性的单克隆抗体。可按照已知方法，如Milstein和K hler(Nature，256495，1976)的方法制备上述杂交瘤细胞株。下面进一步描述制备这类杂交瘤细胞株的优选方法。产生单克隆抗体之杂交瘤细胞株的制备(ⅰ)检测用免疫原及抗原的制备可使用N-(4-溴丁基)苯邻二甲酰亚胺将去甲吗啡或去甲吗啡的盐等类似化合物转化成N-(4-溴丁基)衍生物，并使用1-环己基-3-(2-吗啡代乙基)-碳二亚胺-N-甲-对位-甲苯磺酸盐(下文简称CMEC)、1-乙基-3-(二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(下文简称EDPC)等碳二亚胺化合物将其结合到分子量为10，000或10，000以上的大分子载体(如BSA、OVA、KLH、免疫球蛋白等生物大分子、PLL等多聚氨基酸)上。另一方面，可使用大分子载体和不同于大分子载体的碳二亚胺及用于制备免疫原的碳二亚胺，按上述制备免疫原的方法制备检测分析所使用的抗原。(ⅱ)免疫的小鼠淋巴细胞的制备或一次或分几次(每次间隔数周)给小鼠注射溶解于PBS(Dulbecco′s磷酸缓冲盐水)之上述(ⅰ)的免疫原(10-400μg)，对小鼠进行免疫。第一次免疫也可以不给予含明矾、死结核菌细胞等免疫促进剂的佐剂，但最好给予用佐剂制得的乳剂。最后一次免疫后几天，如检测证实免疫小鼠体内产生了足够的抗体即可由血液、淋巴结、脾脏等组织(最好是脾脏)中得到淋巴细胞。(ⅲ)骨髓瘤细胞的制备为进行细胞融合，可使用来自小鼠的MPC-11、P3-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞株产生的抗吗啡单克隆抗体，特征在于其基本上不与可待因反应，但与吗啡有高度特异的反应活性。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：宇田泰三，伊藤幸胜，宇佐川崇，本行千一，一二三惠美，
申请(专利权)人：宇部兴产株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]