使用了小片多孔膜的细胞培养法制造技术

本发明专利技术的目的在于，提供使用了小片聚合物多孔膜的细胞培养法。本发明专利技术提供一种细胞培养法，其包括：对表面层A或B的面积为4mm2以下的小片聚合物多孔膜应用细胞并进行培养，所述细胞培养法无需搅拌。前述小片聚合物多孔膜具有特征性的三维结构，利用在细胞培养液中小片聚合物多孔膜分散和/或小片聚合物多孔膜彼此相互多层地堆积、在细胞培养容器的底部进行分散和/或层叠的性质，更简便地供给和回收培养基。由此实现长期培养和大量培养，从而能够实现长期稳定地产生外泌体。期稳定地产生外泌体。期稳定地产生外泌体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用了小片多孔膜的细胞培养法


[0001]本专利技术涉及细胞培养和物质产生系统，更具体而言，涉及使用了小片聚合物多孔膜的细胞培养法。另外，涉及具备小片聚合物多孔膜的细胞培养装置和试剂盒。

技术介绍

[0002]细胞培养
[0003]细胞通常以具有三维结构的群体形式存在于生物体内。另一方面，在人工环境中培养细胞时，通常使用如下方法：以细胞呈单层状贴附于培养容器底部的方式进行二维培养的经典平面培养法、在使细胞分散于液体培养液中的状态下进行培养的悬浮培养法。对于用于平面培养法的细胞而言，粘附性相对较高的细胞是适合的，但即使在使用了适合的细胞的情况下，细胞的性质有时也会由于培养环境的差异而发生较大改变。对于悬浮培养法而言，也存在适合的细胞和不适合的细胞。
[0004]随着对疫苗、酶、激素、抗体、细胞因子等用于医疗用途的生物体内蛋白质等的需求的日益增大，利用细胞培养来大量产生生物体内蛋白质等变得越来越重要。另外，随着再生医学中的细胞移植等转向实用化的趋势，高效且简便地培养大量细胞的方法论正引起人们的关注。进而，最近还可见用于高效地产生已实现作为诊断标记物、药物递送载体和生物药物的利用的、能作为生理活性物质发挥作用的外泌体的细胞培养系统的例子。
[0005]对于大肠杆菌等悬浮细胞，研究了在大型培养槽中进行大量培养的技术。使用了大型培养槽的悬浮细胞的大量培养中，需要大量的培养液和搅拌装置。另一方面，使用粘附细胞进行物质产生的研究也随着所使用的细胞的研究进展而受到人们关注。若想大量培养粘附细胞，经典的平面培养法的情况下，由于只能以二维方式使细胞展开而需要很大的培养面积。
[0006]作为在立体环境中培养大量的细胞的方法，报道了使用生物反应器、细胞培养载体的方法(非专利文献1、专利文献1)。作为使用生物反应器的方法，有：将玻璃纤维等纤维状物质堆积在柱内，在该空间内连续培养细胞而产生物质的方法(专利文献2)。另外，作为代表性的细胞培养用载体，作为能够附着培育出细胞的小颗粒的微载体成为被广泛研究的对象(专利文献3、4)。
[0007]如专利文献4中以产生为例所示，为了通过使用微载体的细胞培养法来增加产物的量并提高效率，最重要的课题在于实现在高密度下的细胞培养。另外，如何使细胞高效且简便地增殖、如何能将细胞移植/接种在作为载体的微载体上也成为重要的课题。关于这点，在使用微载体的细胞培养系统中，为了使微载体彼此不聚集，需要充分地搅拌/扩散。因此，需要足矣充分地搅拌/扩散分散有微载体的培养液的体积，因此能培养的细胞密度存在上限。另一方面，为了通过搅拌而实现充分的营养供给，细胞不会容易地被剥离变得尤为重要，因此对剪切力的耐受性成为不可欠缺的特性。进而，为了将微载体和培养液分离，需要用能够分离较细的颗粒的过滤器进行分离等，在量和效率方面仍存在课题。另外，已经创造出很多三维培养技术，但如水凝胶、球状体法等大多数是临时培养技术或面向评价的技术，
实际上尚没有报道能够长期产生物质的培养方法。为了生物药品、生理活性稀缺物质或外泌体之类的物质的稳定生产，需要稳定的长期培养技术。与此相关，包括间充质干细胞在内的原代细胞的长期培养已有很多报道(非专利文献2；非专利文献3)，但其无法作为细胞培养系统的制造方法。
[0008]认为外泌体所具有的生理活性受到被受外泌体来源细胞控制的核酸、蛋白质的构成的支配，在细胞培养中的诱导期、对数生长期、静止期和死亡期的各阶段中所产生的外泌体的品质发生变化。因此，在考虑以工业规模生产外泌体时，外泌体的特性随着培养时间而发生变化在品质管理方面是不优选的，要求在已建立的生产系统中能够长期产生品质均一的外泌体。在现有的使用培养细胞的外泌体产生技术中，这样的细胞培养系统的随时间经过所导致的外泌体的品质变化的问题尚未得到充分解决，成为阻碍品质稳定的外泌体的供给、建立工业规模的外泌体产生系统的技术壁垒。
[0009]另外，从细胞培养中的供氧的观点出发，细胞培养中，无论是否使用细胞培养用载体，另外，无论是悬浮细胞还是粘附细胞，除厌氧细菌外供氧是细胞健康生长的重要课题。例如，使用培养盘、孔板或腔室对粘附细胞进行平面培养时，对于培养容器的面积而言，培养基量的合适范围存在限制。因此，在使用不必要的大量培养基时，无法向细胞供给充足的氧气，也有可能会出现由低氧所引起的损伤的情况、导致细胞死亡的情况。另外，已知：细胞群形成球状体时，若其尺寸变得过大，则内部的细胞就会陷于缺氧状态(非专利文献4)。针对这样的供氧课题，尝试了通过利用微泡来提高氧气浓度(专利文献5)、微载体培养时均匀的供氧方法(专利文献6)等。另一方面，已知：间充质干细胞的培养中，该细胞更适宜在低氧环境中生息、增殖，因此需要根据细胞的种类在细胞培养时增减供氧这样繁杂的操作。因此，一直在寻求开发和构建一种细胞培养法，该方法能够通过简便且适合自动化的工艺容易地调节所提供的氧气量，进而能够培养大量的细胞。
[0010]本专利技术人等已经提供了使用聚合物多孔膜的细胞培养法和细胞培养装置，但为了防止膜状的聚合物多孔膜的连续形态变化，将在壳体(外壳)中收纳聚合物多孔膜而成的细胞培养模块应用于细胞培养容器、细胞培养装置、或细胞培养系统(专利文献7：“细胞培养模块”)。由此，可防止对在聚合物多孔膜内生长的细胞所施加的应激，凋亡等得到抑制，能够稳定培养大量的细胞。然而，使用细胞培养模块的细胞培养法中，需要用于收纳聚合物多孔膜的壳体，并且用于放入该壳体的细胞培养容器本身的大小、强度是受限的。
[0011]<聚酰亚胺多孔膜>
[0012]聚酰亚胺多孔膜在本申请之前已被用于过滤器、低介电常数膜、燃料电池用电解质膜等主要与电池相关的用途中。专利文献8～10中，特别记载了一种聚酰亚胺多孔膜，气体等物质透过性优异，孔隙率高、两表面的平滑性优异、强度相对较高、具有大量的尽管孔隙率高但对膜厚度方向的压缩应力的耐力优异的大孔隙。它们均是经由酰胺酸而制作的聚酰亚胺多孔膜。
[0013]现有技术文献
[0014]专利文献
[0015]专利文献1：日本特开昭62
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065681号公报
[0016]专利文献2：国际公开第2008/084857号
[0017]专利文献3：日本特开平7
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313151号公报
[0018]专利文献4：国际公开第2003/054174号
[0019]专利文献5：日本专利第5549209号公报
[0020]专利文献6：日本专利第5460241号公报
[0021]专利文献7：国际公开第2018/021368号
[0022]专利文献8：国际公开第2010/038873号
[0023]专利文献9：日本特开2011
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219585号公报
[0024]专利文献10：日本特开2011
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219586号公报
[0025]非专利文献
[0026]非专利文献1：Ogata e本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种细胞培养法，其为包括将细胞应用于小片聚合物多孔膜并进行培养的、无需搅拌的细胞培养法，其中，所述小片聚合物多孔膜是具备具有多个孔的表面层A和表面层B、及夹持于所述表面层A和表面层B之间的大孔隙层的三层结构的小片聚合物多孔膜，其中，存在于所述表面层A的孔的平均孔径小于存在于所述表面层B的孔的平均孔径，所述大孔隙层具有与所述表面层A和B结合的隔壁、及被该隔壁以及所述表面层A和B包围的多个大孔隙，所述表面层A和B中的孔与所述大孔隙连通，所述表面层A或表面层B的面积为4mm2以下，在培养液中所述小片聚合物多孔膜分散和/或小片聚合物多孔膜彼此多层地堆积，在细胞培养容器的底部进行分散和/或层叠。2.根据权利要求1所述的细胞培养法，其通过间歇地或连续地更换培养基来进行长期培养。3.根据权利要求1或2所述的细胞培养法，其中，使粘附于所述小片聚合物多孔膜上的细胞增殖后，通过酶处理将细胞剥离，将未粘附细胞的小片聚合物多孔膜添加至细胞培养容器中，由此使细胞传代来进行大量培养。4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养法，其中，所述小片聚合物多孔膜具有平均孔径0.01～100μm的多个细孔。5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：萩原昌彦，日高泉展，原田崇司，此岛隼人，
申请(专利权)人：宇部兴产株式会社，
类型：发明
国别省市：