C型肝炎病毒的检测方法技术

本发明专利技术提供了源自称为ＫＨＣＶ的新型Ｃ型肝炎病毒ｃＤＮＡ制备的多核苷酸，和由此编码的多肽以及针对这些多肽的抗体。此外也提供了用上述任何材料作为活性成分制备的诊断试剂和疫苗。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新型C型肝炎病毒(KHCV)cDNA的寡核苷酸及由此编码的多肽和针对多肽的抗体;以及利用这些活性制剂，即寡核苷酸、多肽和抗体，制备的诊断产品和疫苗。大家知道通常病毒性肝炎是指由各种肝炎病毒诱发的疾病，包括A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、δ型肝炎病毒和E型肝炎病毒、巨细胞病毒和E-B病毒。自从1980年以来，这些病毒的基因类型已经搞清，为开发诊断制剂，疫苗和治疗制剂提供了方便。进而业已发现一种被称为非A非B型或C型新型肝炎，其中80%-90%的病例是由输血引起的，往往这种输入型肝炎大约50%可发展成肝硬化或肝癌。病人血中存在的C型肝炎病毒(HCV)的数量通常非常少。与HCV相关的抗原抗体系统的特性还不为人们完全理解，因此，开发治疗和诊断制剂还有许多困难。后来，许多科学家对HCV的研究非常重视(Alter H.J.et al.，Lancet，459-463(1978);Tabor，E.et al.，Lanet，463-466(1978);Hollinger F.B.et al.，Intervirology，10，60-68(1978);Wyke，R.J.et al.，Lancet，520-524(1979);Bradley，D.W.et al.，J.Med.Virol.，9，253-269(1979)]。Bradley等确定了HCV的部分生化和生物物理特性。他们用一个C型肝炎病人的血清感染了一只猩猩(champanzee)，从而获得了许多血清;再从这些血清中提取了HCV病毒，对此病毒进行了分析和研究。自那以后，采用Bradley方法分离HCV病毒用于开发诊断、预防或/和治疗C型肝炎的制剂的研究非常多。Choo等用C型肝炎病人的血清感染猩猩之后，从其血清中分离出HCV病毒，并对其部分cDNA片段进行了克隆。证明在大肠肝菌和酵母菌体内由这段cDNA表达产品的蛋白质能和C型肝炎病人血清中的抗体发生免疫活性反应。(Science，244，359-362(1989)]。Kuo等(Science，244，362-364(1989)]由美国Chiron公司鉴定的部分HCV cDNA片段和超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母细胞中表达了C100-3蛋白质。该蛋白质与C型肝炎病人血清有免疫学反应，也能与70%的输入型肝炎病人血清反应。Houghton等进一步描述了HCV抗原的用处，特别是C100-3蛋白，它是从患C型肝炎猩猩体内分离出的HCV基因序列所编码的。因此，称其为美洲型HCV。用此抗原去制备疫苗和能检测HCV抗体的诊断试剂(CT WO 89/04669;WO 90/11089);建立一种用这类抗原(如，C100-3)参与的酶免疫测定诊断法。以上述为基础，美国Ortho诊断系统公司在1990年开发并检测HCV抗体的诊断产品。可是，所说的C100-3抗原在用于诊断制剂中活性成份时仅与慢性C型肝炎病人抗体反应，不和急性期病人特别是疾病早期阶段的血清反应。此外，由于该蛋白中融合有SOD因而常出现一些假阳性结果。另一方面，按Houghton等人的方法，部分HCV cDNA克隆也被得到。HCV病毒是从收集的日本C型肝炎病人血清中得到的，包括5′-末端区和编码核心蛋白和外膜蛋白的结构基因。已经确定了其cDNA克隆的核苷序列，结果发现该序列与美洲型HCV有约10-15%的不同。这表明的确出现了一种新型，称为日本型;由日本型HCV得到的抗原制备的疫苗和针对日本型HCV的诊断制剂也已有报导。Harada等的报告指出当编码结构基因5′-末端的核心抗原被用于疑为HCV感染的病人核品中，诊断HCV的抗体时，该法可能要比用C100-3蛋白检测抗体提早6-8周。Lesniewski等也介绍了一种采用多种抗原的改进诊断法，该法要比单用C100-3抗原法敏感和特异。Wang在EP公开号442394(1991)上介绍了另一种诊断方法，该法中选用了多种由15-65氨基酸组成的表型决定簇多肽作为抗原检测HCV抗体。这些多肽是从10个不同的HCV表型决定簇中挑选出来的。上述公开物表明可用携带不同表型决定簇的多肽混和物替代单一种的抗原，从而改进提高HCV的诊断。然而，以糖蛋白形式存在于病毒表面的外膜蛋白已经显示有可能用于开发疫苗或诊断制品。因为与HCV很相似的黄病毒(flavivirus)，已知外膜蛋白和非结构蛋白(ICNS1)在诱导宿主免疫反应中起着重要的作用，而且在把该蛋白结合到宿主细胞受体也起着重要作用。此外，业已报导针对外膜蛋白抗体形式密切与C型肝炎康复有关。进一步Houghton等携测外膜2蛋白(E2)很可能证明是一种重要的抗原用于制备C型肝炎疫苗，为此，所说的E2蛋白质有人认为与免疫反应机制有密切的关系。因为E2蛋白的氨基端表明的了显著的种导质性(The 3rd International HCV Symposium，p20，Strasbourg，France，1991);对日本型和美洲型HCV基因型的核酸序列比较后发现，虽然编码核心蛋白的序列有约91%的同源性，但编码外膜蛋白的同源性反约74%。如前所述，HCV病毒在许多不同国家被发现并表现出地区异质性，而这种异质性可能在决定疫苗的效力和诊断制剂的敏感性和准确性上都是非常重要的因素。据此，本专利技术仅涉及从朝鲜C型肝炎病人(KHCV)分离出的新型HCV的分离和鉴定，不同于已发现的HCV包括美洲型和日本型。需倍加说明，本专利技术提供了已知KHCV全序列分析cDNA和几株HCV变异株cDNA的部分定序。从KHCV的部分cDNA序列被用于诊断假定样品中病毒存在的探针或前导序列(Primer，是指用于PCR检测中的引物DNA-译者注)。使用这种核苷酸序列的诊断试剂盒(kit)和方法也组成了本专利技术的内容。除此之外，本专利技术提供了由上述cDNA编码的多肽，这在诊断试验试剂或/和疫苗组成中非常有用。所说的多肽是指一大类各种不同的多肽，其中包含有重组多肽，如带有一个非HCV蛋白的融合多肽所构成的KHCV的表型抗原决定簇以及由此而来的各种纯化产品。本专利技术另一方面涉及一个重组表达载体，该载体是由KHCV cDNA的一个敞开阅读框架(ORF)组成。而这个ORF完全能被自由地联接到一个能与目的宿主微生物相容的调节序列。这种载体可包括一段编码一种非KHCV蛋白的核苷酸序列以用于制备一种与来自KHCV或其它型病毒蛋白或多肽的多核苷酸的融合片段;一株用这种重组表达载体转化的宿主细胞;以及由此而产生出的多肽。本专利技术进一步所涉及的内容就是生产含有KHCV表型决定簇多肽的方法，即培养含有表达载体转化的宿主细胞，该载体内含有编码KHCV表型决定簇多肽的一段序列;以及由此而生产出的含有KHCV表型决定簇多肽。本专利技术还包括针对KHCV表型决定簇的单克隆抗体和生产这种单克隆抗体的杂交瘤细胞。由一种以上多肽，其中包含一种以上KHCV表型决定簇组成的诊断制剂作为活性成份用于检测假定样品中KHCV抗体以及由这些试剂构成的诊断试剂盒也属于本专利技术的范围。由一种或多种针对KHCV抗原作为活性成份用于检测假定样品中HCV抗原的诊断制剂以及由此而构成的诊断试剂盒又是本专利技术的另一个方面。本专利技术还需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含其自身片段的朝鲜型Ｃ型肝炎病毒（ＫＨＣＶ）ｃＤ－ＮＡ。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹重明，李庸范，林国镇，苏弘燮，金成泽，朴荣祐，崔德永，金天炯，梁宰荣，
申请(专利权)人：株式会社乐喜，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]