人乙型肝炎病毒DNA制造技术

ＰＣＲ引物对，包含用来选择性地扩增人乙型肝炎病毒ＤＮＡ的１７０１－１７９４区的ＤＮＡ。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人乙型肝炎病毒(HBV)的检测方法。具体地讲，本专利技术涉及检验HBV前核(Pre-C)区并同时确定其基因型的方法，以及涉及用于该方法的DNA试剂。
技术介绍
自1976年Greenberg和其同事首次报道了用干扰素(IFN)治疗慢性乙型肝炎(Greenberg，H.B.N.Engl.，J.Med.，295，517-522，1975)以来，已有许多报道是关于IFN对HBe抗原阳性的慢性乙型活动性肝炎的功效的，这些报道赢得了不同程度的认可。通常，慢性乙型肝炎的发作过程的特征是出现一个HBe抗原阳性期和HBe抗原阳性后期。在HBe抗原阳性期，HBV进行活性复制，血液HBV DNA和DNA聚合酶的活性水平增高，活动性肝炎的组织学症状明显，而且在多数情况下，可发现肝损伤；在HBe抗原阳性后期，HBe抗原消失而HBe抗体出现(血清转换发生)，结果是HBV的复制平息下来并伴随着肝损伤的缓解。因此，在HBe抗原、HBV DNA和DNA聚合酶均呈阳性的慢性活动性肝炎期间，给药INF以期望加强HBe抗原的清除和有利于HBe抗体的血清转换。然而，还存在HBe抗原呈阴性或HBe抗体呈阳性的慢性乙型肝炎，该种肝炎显示出血液HBV DNA和DNA聚合酶水平高、病程发展快、较难诊断。在这种肝炎中检测到的HBV DNA显示出，在Pre-C(前核)区的83位有一从G到A的突变，所述的前核区与HBe抗原分泌到血液中有关，因此，认为此种HBV是不产生HBe抗原的病毒(CarmanW.J等，Lancet，ii，588-591，1989)。在上述的Pre-C突变存在下，HBe抗体和抗原的检测值可能导致误诊，即导致误诊为血清转换正在发生并因此肝损伤将会适时得以缓解。所以，在IFN治疗慢性乙型肝炎的疗法中，人们认为检测并定量上述DNA区的突变将为制定将来的治疗方案或预测该治疗的预后结果提供有用的标记。检测和测定HBV的Pre-C区突变的己知方法是通过采用一组引物的MSSA的竞争性反应分析法，所述的引物与Pre-C区的83位的突变具有同样的序列〔Kinoshita，M.等，CCA，228，83-90，1994〕。然而，上述方法具有以下缺陷(1)因为该方法包括使用8个不同标准物(从101到108个拷贝)的竞争性反应，对每个样品必须进行8次分析，因此检测大量的样品需要浪费大量的时间。(2)该方法仅限于Pre-C的83位的突变，不能对野生型病毒和其他突变同时进行测定。另一方面，已知聚合酶链式反应-单链构型多态(PCR-SSCP)分析是检测突变的方法(如，Orita M.等，Genomics，5，874-879，1989〕。该方法利用了不同构型单链DNA电泳迁移率之间的差异。在该SSCP分析中，理想的是优选待测DNA具有均一的构型并因此产生一条带，但是已知待测DNA实际上可能以几种亚稳定态的结构存在并产生数条带；因此限制了该方法的利用〔Analytical Chemistry，43，731-743，1994〕。至今还没有通过PRC-SSCP分析来定量分析或鉴定HBV Pre-C区突变的报道，因此同时检测和测定所述突变的方法也是未知的。本专利技术的公开本专利技术的目的在于提供，通过一次反应即可分析HBV Pre-C区突变体和野生型病毒基因型以及同时测定该基因型的DNA试剂和方法。为实现上述目的，本专利技术人进行了大量的通过PCR-SSCP分析来鉴定HBV Pre-C区突变体的研究，并发现了包括待测HBV Pre-C区突变体的所有突变位点的特定区域，对于每一突变DNA和野生型病毒DNA，该区域仅具有一种特定的构型，因此在每一SSCP分析中仅产生一条带，这些DNA在迁移率上的差异足以使DNA在SSCP分析中被区分开。本专利技术是在上述发现的基础上完成的。本专利技术提供了包括HBV DNA 1701-1794区的DNA片段。另一方面，本专利技术提供了HBV是野生型病毒或在Pre-C区有至少一个突变的突变病毒的DNA片段，所述的突变选自38位的G被A的取代、42位的T被C的取代、80位的T被C的取代、83位的G被A的取代、86位的G被A的取代。本专利技术还提供了具有选自SEQ ID NO3、NO4、NO5、NO6、NO7和NO8的序列的DNA片段。再一方面，本专利技术提供了用来选择性扩增HBV DNA的1701-1794区的PCR引物对，优选的是SEQ ID NO1和NO2引物对。本专利技术还提供了HBV的检测方法，该方法包括采用所述的引物对和作为标准物的DNA片段。认为包括38位的G被A的取代、42位的T被C的取代、80位的T被C的取代、86位的G被A的取代的上述Pre-C区的各突变体是本专利技术提供的新突变体。在本说明书中采用的关于氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸、限制酶等等的缩写是按照IUPUC和IUPUC-IUB推荐的命名法以及撰写包含核苷酸序列或氨基酸序列的说明书的指南(日本专利局协作部，审查标准处，1994年11月)来的。而且，本说明书中采用的HBV的核苷酸序列编号与已知的核苷酸序列的编号(Gene，30，227-232，1984)一致。本专利技术引物对的特征在于，它被用来选择性地扩增HBV DNA的1701-1794区。可按照任何常规的方法来设计该引物，只要所述的区域是可扩增的。所设计的引物对的优选例子是在下文的实施例中描述的SEQ INNO1和NO2引物对。本专利技术的SEQ IN NO1引物(寡聚-DNA)具有HBV DNA Pre-C区正链的核苷酸序列，该引物能使上述的特定区域扩增。本专利技术的SEQ IN NO2引物(寡聚-DNA)具有HBV DNA Pre-C区负链的核苷酸序列。可成功地将这两个引物用作本专利技术的引物对，而且可化学合成这两个引物对，例如通过亚磷酰胺法来合成之。用于本专利技术的化学合成方法以及各种方法如进行DNA裂解、缺失、增加或剪接的酶处理以及DNA分离、纯化、转录、筛选等方法均可按照常规方式进行(Bunshi-IdengakuJikkenho(Experimental Protocols in Molecular Genetics)，Kyoritsu Shuppan，1983；PCR Technology，Takara Shuzo，1990)。例如，可通过琼脂糖凝胶电泳进行DNA的分离和纯化，DNA的测序可通过例如双脱氧法(Sanger，F.，Nicklen，S.和Coulson，A.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，74，5463-5467，1977)或Maxam-Gilbert法(Maxam，A.M.和Gilbert，W.，Method in Enzymology，65，499-560，1980)进行。DNA的测序也可采用市售的测序试剂盒进行。这些基本的方法也被用在本说明书所提及的各研究报告中，并可参阅那些文献以及下文给出的实施例。本专利技术所提供的由HBV DNA的1701-1794区组成的DNA片段是包括要由PCR-SSCP分析测定的HBV Pre-C突变体的所有突变位点的特定区域，对于每一突变的和野生型病毒DNA，该区域可能仅具有一种特定的构型，因此在每一SSCP分析中仅产生一条迁移带，这些DNA具有足以使DNA在SSCP分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：木下盛敏，葛城肃典，
申请(专利权)人：大制药株式会社，
类型：发明
国别省市：