用于分析的方法和生物传感器技术

在分析方法中，使用连接在基质（１）的固体表面上的生物分子（３）通过分析物与生物分子的结合来检测样本中存在的分析物（４）。生物分子（３）与生物分子排斥分子（５）一起直接连接在基质的表面上，生物分子排斥分子覆盖生物分子（３）之间的表面以防止分析物（４）与其它生物分子的非特异性结合。本发明专利技术还涉及生物传感器，其中生物分子（３）与生物分子排斥分子（５）一起直接连接在基质的表面上，生物分子排斥分子覆盖生物分子（３）之间的表面以防止分析物（４）与其它生物分子的非特异性结合。生物分子排斥分子（５）可以是自我装配的亲水性聚合物。使用本发明专利技术的一个实例是使用表面胞质基因组共振（ＳＰＲ）的免疫分析。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析方法。本专利技术还涉及用于进行所述方法的生物传感器。
技术介绍
对于帮助临床诊断和环境分析的简单、快速和易于使用的传感器的需求在不断增加。在传统上，在临床实验室中已经通过放射免疫分析、固相酶免疫分析和荧光免疫分析方法来测定抗体与抗原之间非常特异和紧密的结合。抗体-抗原复合物的定量测定依赖于标记分子例如放射同位素、酶或荧光探针。在大多数情况下，只有在进行了几次培养、洗涤和分离步骤之后才能获得结果。目前正在开发可借助于被固定的抗体来即时监测抗体浓度，并且不需要使用标记物的免疫传感器。然而，在使用常规固定方法时，对于抗体定向缺乏控制限制了可利用的结合位点的比例。另一方面，位点特异性固定带来较高的活性。对于抗体的控制固定的选择包括抗体的Fc区与蛋白A或蛋白G的特异性结合，经由抗体Fab′-片段上的游离巯基共价连接到支持层上，和通过生物素/(链霉)抗生物素蛋白化学将生物素化的抗体偶联到表面上。仍然，最近已经表明，Fab′-片段可以以高表位密度直接吸附到金上。金属表面的高表面能通常导致生物分子变性，从而使活性下降。已对该吸附机理进行了充分研究，并且其涉及材料的表面与生物分子表面上的疏水性膜片之间的疏水性相互作用。初始吸附之后，蛋白可变性，并解折叠以暴露出更多的疏水性基团，由此失去活性。描述使用在表面上形成用于连接生物分子的单层的各种连接分子，来制备其中可通过表面胞质基因组共振来进行检测的生物传感器的专利文件包括US专利5242828与欧洲专利442922和485874。能够以定向和可再现方式以最小解折叠连接到转导物介面上的受体分子可最佳地保持活性和特异性，并且可在需要高灵敏度的传感器应用中使用。这类受体分子的位点定向固定将保证最大结合效率。在生物传感器应用中必须克服的另一个问题是非特异性结合。在如生化、生物、生物技术和健康护理的领域中，生物排斥表面已成为引起很大关注的主题，这是因为需要控制生物分子和细胞与各种表面的相互作用。蛋白排斥表面对于接触血液的植入装置、分离操作用膜、色谱载体、隐形眼镜和血液以及蛋白贮存装置非常重要。生物分子排斥表面可通过将非离子亲水性聚合物例如聚(丙烯酰胺)、聚(N，N-二甲基丙烯基胺)、聚(乙烯醇)、乙烯-乙烯基醇共聚物、聚(羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(氧化乙烯)和聚(乙二醇)固定来制得。对蛋白吸附的抵抗性是基于生物排斥表面的柔性分子链与溶液生物分子的熵和流体动力排斥力大于组合吸引力。已通过物理包被(coating)、化学偶联或接枝共聚来将聚合物吸附。对于生物传感器应用，已有人将提供低聚(乙二醇)的自我装配型(self-assembled)烷硫醇与其中可连接生物分子的具有适当连接基团的分子混合。专利技术概述本专利技术的目的是提供用于分析的方法和生物传感器，所述方法和生物传感器对于分析物具有高特异性结合。可将在单体/聚合物骨架上具有合适的末端锚基团，或具有携带末端锚基团的亲水性单体/聚合物“刷”的生物分子排斥分子与连接在同一表面上的生物分子，尤其是免疫结合分子(受体)例如抗体片段一起化学接枝到固体例如Au、Ag、Cu、Al、Pd和GaAs上以形成单层。这些生物分子排斥分子直接接枝到与生物分子，尤其是免疫结合分子(受体)例如抗体片段相同的表面上，这样它们形成混合单层。生物分子排斥分子防止了在生物分子之间留下的空间中的分析物的非特异性结合。免疫反应可用技术例如表面胞质基因组共振、石英晶体微量天平，和阻抗来检测。固定操作可显著降低分析物的生物大分子的非特异性结合，因为在Fab′-片段之间的表面将是高亲水性和非离子性的，并且抗体片段的适当定向也将导致抗原的高度结合。可将生物分子例如免疫结合分子(受体)以定向方式固定，以提供定量分析连接在生物分子上的分析物分子的适宜方法。O′Brien，J.；Jones，V.；Porter，M.；Anal.Chem.72(2000)703中描述了一种固定抗体片段的方法，该文献引入本文以供参考。在分析中使用这样的测定方法，其与具有固体表面的基质相容，并且与所用的基质一起能够给出低的检测限(detection limit)。生物分子与对固体表面具有亲和力的基团一起直接结合在其上面的固体表面可以是这样的类型，其能够诱导信号改变，这种信号改变被发射到基质上，以与基质、固定的生物分子和结合的分析物的组合相互作用，随后检测作为基质固体表面上的物质增加(选择性地与固定在基质表面上的生物分子结合的分析物分子的蓄积)的指示的信号改变。特别适于达到良好灵敏度和改善方法功效的检测方法是表面胞质基因组共振、厚度剪切模式、表面声波和电化学测定。附图简述通过下列结合附图的描述，本专利技术的目的和特征可得到更好的理解，其中附附图说明图1是传感器表面的图示表现，其中抗体Fab′-片段与生物分子排斥分子一起连接在表面上，并且传感器与抗原相互作用，附图2是附图1的表现，其表示的是，使用胶体/纳米颗粒来放大检测，附图3表示的是依据一个本专利技术实施方案的测定装置，附图4表示的是依据另一个本专利技术实施方案的测定装置，附图5表示的是在将不同大分子连接在金薄膜上时SPR的改变，附图6表示的是用本专利技术传感器获得的SPR结合等温线，附图7表示的是在不同大分子结合到金薄膜上时SPR强度的总变化。优选实施方案的详细描述将生物分子与官能团一起直接固定在基质固体表面上以形成用于分析的一层定向受体。生物分子可以是蛋白、肽、酶、抗体、抗体片段(例如Fab′)、抗原或抗原的一部分。为了进行分析，这些分子应当具有对待检测的分析物有特异性的结合位点，并且它们还可以是下文描述的结合分子或受体。生物分子与连接在同一表面上的生物分子排斥单体/聚合物分子一起经由官能团直接连接在基质的固体表面上，这样生物分子在具有暴露的活性分析物选择性结合位点(例如抗原结合位点、表位等)的表面上自我装配，并且也自我装配的生物分子排斥分子将在生物分子之间留下的固体表面覆盖，以防止在生物分子的活性结合位点之间发生分析物分子的非特异性结合。生物分子和生物分子排斥单体/聚合物具有官能团，所述官能团对于基质的固体表面具有亲和力，并起末端锚基团的作用。例如，末端具有巯基的有机分子可通过在金属与硫原子之间形成共价键而化学吸附到金属例如Au、Ag、Cu、Al和Pd的表面上，并形成单层包被。以上述方式表现出自我装配的系统包括通过含有硫的官能团来自动化学吸附到金属表面上的硫醇、二硫化物和硫化物。如果分析方法是SPR测定，则所用基质是SPR相容性材料例如金、银、铜、铝和钯的膜。然而，本专利技术不限于任何具体分析方法。可通过将生物分子的结构部分转化成官能团，例如通过将前体基团还原成巯基来给生物分子提供官能团。或者，可将含有官能团或其前体的连接分子连接到生物分子上，以给其提供适于自我装配的官能团，然后将生物分子从溶液中化学吸附到表面上。由此在一个步骤中将具有官能团的生物分子直接吸附到基质的固体表面上，以形成其中生物分子以定向方式形成单层的生物传感器。通过化学吸附将生物分子排斥单体/聚合物分子连接在表面上，也以定向方式形成单层。可在同一步骤中或者在将生物分子固定之后将生物分子排斥分子连接在同一表面上。可通过简单的化学吸附将生物分子排斥分子连接在表面上。优选通过在一个聚合物链末本文档来自技高网...

【技术保护点】
分析方法，其中使用连接在基质（１）的固体表面上的生物分子（３）通过分析物与生物分子的结合来检测样本中存在的分析物（４），其特征在于，生物分子（３）与生物分子排斥分子（５）一起直接连接在基质的表面上，生物分子排斥分子覆盖生物分子（３）之间的表面以防止分析物（４）与其它生物分子的非特异性结合。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：I维克霍姆，J萨多夫斯基，
申请(专利权)人：比恩诺尔股份公司，
类型：发明
国别省市：FI[芬兰]