功能化纳米微粒及其使用方法技术

用生物活性的分子，如抗体和核苷酸对涂有氧化硅的纳米微粒进行官能化，并用于标记细胞，检测和分离具有特定核苷酸序列的核酸分子，分离不同核酸分子的混合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及纳米微粒和制备及使用纳米微粒的方法。更具体地说，本专利技术涉及涂敷生物活性物质的纳米微粒，以及使用这种纳米微粒的方法。
技术介绍
纳米微粒是非常小的颗粒，其直径通常小达1纳米到大达数百纳米。因为尺寸小，纳米微粒有待用来生产各种产品，例如许多不同的生物和医药应用中的有用工具。专利技术概述本专利技术基于开发与一种或多种生物活性分子，如核酸、抗体和酶结合的纳米微粒。本专利技术的纳米微粒可用作信号探针和分离工具，用于超灵敏细胞标记和核酸的分析及分离。因此，本专利技术的特征是将纳米微粒定向靶分子的方法。该方法包括如下步骤提供具有氧化硅表面的纳米微粒，氧化硅表面与至少一个能与靶分子特异性结合的官能团偶联；然后在至少一个官能团与靶分子结合的条件下，纳米微粒和靶分子混合在一起。所用纳米颗粒可具有被氧化硅表面包封的一个芯。所述芯可以是金属(例如磁性金属)或染料(例如有机或无机染料)。偶联氧化硅表面的官能团可以是蛋白质，如抗体、酶、抗生物素蛋白或生物素，也可以是核酸，如DNA。核酸可呈分子信标的形式，例如与荧光团和荧光团的淬灭剂偶联的分子信标。官能团可以通过生物素-抗生物素蛋白与氧化硅表面偶联。与纳米微粒定向结合的靶分子可以是细胞内、细胞表面上的分子或在细胞内部。细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞(例如癌细胞)，也可以是原核细胞，如细菌。靶分子也可以包含在液体中。本专利技术方法还包括检测纳米微粒与靶分子结合的步骤，例如通过观察纳米微粒的性质(例如光发射)的改变来检测纳米微粒与靶分子的结合。如果靶分子包含在混合物内，则该方法可包括将含有纳米微粒的复合物从混合物中分离出来的步骤，其中纳米微粒结合在靶分子，还包括将靶分子从复合物中分离出来的步骤。这里所用词汇“纳米微粒”是指直径在约1-1000nm之间的微粒。纳米微粒的“尺寸”是指纳米微粒最大的直线尺寸的长度。例如，完整的球形纳米微粒的尺寸是其直径。这里所用“核酸”或“核酸分子”是指两个或多个核苷的链，如RNA(核糖核酸)和DNA(脱氧核糖核酸)。“纯化的”核酸分子是指细胞或生物体的其他核酸序列中基本分形或分离的核酸分子，其中核酸是天然产生的(例如30、40、50、60、70、80、90、95、97、98、99、100％无污染物)。这里所用“蛋白质”或“多肽”是同义词，指由氨基酸的任何肽连接的链，不管长度或翻译后修饰，例如糖基化或磷酸化。当涉及一种核酸与另一种核酸的杂交时，“低严格条件”指在42℃10％甲酰胺、5X Denhart溶液、6X SSPE、0.2％SDS中，接着在50℃1X SSPE、0.2％SDS中洗涤；“中等严格条件”指在42℃50％甲酰胺、5X Denhart溶液、5X SSPE、0.2％SDS中，接着在65℃0.2X SSPE、0.2％SDS中洗涤；“高严格条件”指在42℃50％甲酰胺、5X Denhart溶液、5X SSPE、0.2％SDS中，接着在65℃0.1X SSPE、0.1％SDS中洗涤。“严格杂交条件”指低、中等或高严格条件。这里所用“序列同一性”是指当两个序列对齐使亚基配对最大化时，在两个序列中的对应位置上相同亚基的百分数，即要考虑到间隙和插入。当两个序列中的亚基位置被同样核苷或氨基酸所占据时，存在序列同一性，例如，如果一个特定位置被各自的两个DN中的腺嘌呤占据时，分子在该位置上是相同的。例如，如果10个核苷酸长度的序列中17个位置与另一10个核苷酸序列中的对应位置相同，则两个序列的同一性为70％。序列同一性通常用序列分析软件测定(例如，威斯康辛大学生物技术中心基因计算组开发的序列分析软件包，学府大道1710，麦迪逊，W威斯康辛53705)。这里所用“抗体”包括完整多克隆和单克隆抗体，以及抗体片段。“词组特异结合”指样品中的一个分子识别并粘附于特定的另一个分子上，但不充分识别或粘附于样品中的其他分子。一般地，与第二个分子“特异结合”的第一个分子是指结合具有结合亲和力大于约105-106mol/l的和二个分子的分子。这里所用词组“官能团”指化学基团，它能赋予含有化学基团的物质(例如纳米微粒)一种特定功能。例如，官能团可以包括生物活性物质，如抗体、寡核苷酸、生物素或链霉抗生物素蛋白，已知它们与特定分子结合；或者小的化学基团，如胺、羧酸盐等。词组“与……偶联”指共价或非共价键键合，或相反例如通过直接或间接连接稳定地紧靠着相连。例如，涂敷有抗生的素蛋白的纳米微粒可通过抗生物素蛋白-生物素连接与生物素化抗体偶联。除非另有说明，这里所用的全部技术术语与作为本专利技术所有领域中普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的方法和材料类似或相等的方法和材料也可以用于本专利技术的实践或测试中，但下面介绍合适的方法和材料。这里提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都纳八本文作参考。在冲突的情况下，则以本说明书，包括定义为准。此外，下面所讨论的具体实施方式仅是说明性的，不是对本专利技术的限制。附图简述附图说明图1是本专利技术所用纳米微粒的剖面图。图2是制备本专利技术所用纳米微粒的方法中涉及的一般步骤的流程图。图3是用纳米微粒标记细胞的方法的两个示意图(A和B)。图4是检测核酸分子存在的方法的示意图。图5是用分子信标(MB)特异结合并检测具有特定核苷酸序列的靶核酸分子的高度简化示意图。图6是从核酸与蛋白质的复杂混合物中分离感兴趣的多核苷酸(DNA1’)中涉及的步骤的示意图。图7是用于检测本专利技术核酸的一碱基错配选择性方法的两个图。(A)是来自完全互补核酸的信号与来自单碱基错配核酸的信号；(B)是来自A-T单碱基错配核酸的信号与来自G-C单碱基错配核酸的信号。图8是在MB固定于基因磁性纳米俘获剂(MB-GMNC)或游离于溶液的条件下，显示MB与靶DNA双联的熔化温度曲线的一系列图。图9是显示MB-GMNC从复杂DNA-蛋白质混合物中俘获痕量DNA靶的能力的图。图10是显示MB-GNMC从细胞裂解液中俘获痕量靶mRNA的能力的图。专利技术详述生物活性的氧化硅涂层纳米微粒是用油包水微乳液方法制备的，该方法产生大小均匀的颗粒，所述颗粒由被氧化硅壳包封的芯组成。微乳液的制备方法是，组合相对极性液体(如水)、相对非极性液体(如液态烷烃)和一种或多种表面活性剂，形成各向同性、热力学稳定的单相体系。此体系包含许多很小的球形水池(即反胶团)，作为产生纳米微粒芯的反应器。芯产生后，用硅化剂，如原硅酸四乙酯(TEOS)涂敷氧化硅。为了使这些氧化硅涂层的纳米微粒具有生物活性，氧化硅涂层与一个或多个生物活性官能团偶联，如核酸或多肽。下面描述的优选实施方式说明了本专利技术的各种适应。尽管如此，从这些实施方式的描述中，通过对下面讨论的部分稍作调整或改进，容易地适合本专利技术的其他方面。纳米微粒的特点在简要描述中，用图1表示，本专利技术的优选纳米微粒10包含芯12、涂覆芯12的壳14和衍生到壳14上的一种或多种官能团16。尽管纳米微粒10的直径可在约1-1000nm或更大的范围，对于许多应用，优选在约10-300nm(例如，约10、15、20、25、30、35、50、75、100、150、200、250或300nm)之间。在大量纳米微粒10的分散液中，尺寸分布的标准偏差最好不超过纳米微粒10的平均直径(或最大直线尺寸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使纳米微粒定向靶分子的方法，该方法包括如下步骤：（ａ）提供具有氧化硅表面的纳米微粒，所述氧化硅表面与至少一个能与靶分子特异结合的官能团结合；（ｂ）在所述至少一个官能团能结合靶分子的条件下，混合纳米微粒和靶分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：W谭，J寿光，X赵，RT戴蒂奥科，TJ德拉克，LR西拉德，
申请(专利权)人：佛罗里达州立大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]