一种荧光生物传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种荧光生物传感器的制备方法及其应用，使用携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光作用，利用G-四连体和铜纳米粒子之间产生光诱导电子转移使铜纳米粒子的发光产生猝灭的现象，制备出基于携带胸腺嘧啶DNA为模板的铜纳米粒子与光诱导电子转移体系构建荧光传感器，利用目标(HBV基因)和探针结合形成结构紧凑的体系拉远G-四连体和铜纳米粒子之间距离的原理，实现了对HBV基因灵敏性、特异性的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于荧光传感器制备
，具体涉及一种荧光生物传感器的制备方法 及其应用，是一种基于无标记的携带聚胸腺嘧啶的单链DNA为模板的铜纳米粒子与目标调 节的光诱导电子转移体系构建的荧光生物传感器，在检测HBV基因的应用。
技术介绍
乙型肝炎病毒（HBV)是一种DNA病毒，可通过血液、精液和其他体液进行传播，是 全球最常见的传染性很强传染病之一，可能会导致慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌。乙型肝 炎病毒（HBV)属嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae)，基因组长约3. 2kb，为部分双链环状 DNA〇 全世界大约有二十亿人已经感染此病毒，大约有3. 5亿人处于感染阶段，各国均 面临由HBV病毒感染引发的挑战和威胁，早期诊断HBV基因带来的致命性突变显得尤为紧 迫。 目前对于HBV基因在实际样品中的检测多涉及复杂和耗时冗长的检测过程，或是 涉及到外部荧光信号分子的标记，因此开发高选择性、高灵敏性、简单无标记的荧光生物传 感器检测HBV基因至关重要。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种荧光生物传感器的制备方法，基于无标 记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光与目标调节的光诱导电子转移构 建的荧光生物传感器，利用无标记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA模板，产生铜纳米粒子发光 体，构建由HBV基因调节的光诱导电子转移的荧光传感器。 本专利技术还提供了一种荧光生物传感器的应用，利用制备的荧光生物传感器，不同 浓度的HBV基因荧光强度不同，构建线性关系，实现了对HBV基因灵敏性、特异性的检测。 本专利技术提供的一种荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)、将ssDNA溶液加入缓冲溶液中、然后加入HBV基因溶液，一段时间后，加入 hemin (血晶素）溶液和KC1溶液，培养，得到混合溶液；(2)、在步骤（1)制备的混合溶液中，加入CUS(V§液和抗坏血酸钠溶液，培养10 分钟，利用ssDNA上的探针和HBV基因碱基互补配对，阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的 G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产生光诱导电子转移作用的原理，制备得 到 "关闭"的荧光生物传感器。 步骤⑴中体积比ssDNA溶液：缓冲溶液：HBV基因溶液：hemin溶液：KC1溶液= 2:160:2:1:10。 进一步的，步骤⑴具体为：将2 y L的ssDNA溶液加入160 y L的10mM MOPS (3- (N-吗啉基）丙磺酸）PH = 7. 6的缓冲溶液中，然后加入2 y L HBV基因溶液，5min 后，加入1 y L的hemin溶液和10 y L的KC1溶液，培养，得到混合溶液； 进一步的，所述培养的条件为37 °C培养2h。 进一步的，所述ssDNA溶液制备方法为：将ssDNA序列溶解在10mM MOPS PH = 7. 6 的缓冲溶液中，ssDNA基因序列的浓度为500nM。 进一步的，所述ssDNA序列为携带聚胸腺嘧啶的单链DNA序列：GGGTTGGG-polyT 3 。-TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACTGGGTAGGG，其中含有 polyT30、被拆分成两部分的 G4 序列和 探针序列：TCAGAAGGCAAAAAAGAGAGTAACT ;所述polyT30是由30个T碱基构成的DNA序列。 进一步的，步骤（1)中所述hemin溶液浓度为1. 0 y M溶液；所述KC1溶液浓度为 50mM〇 进一步的，步骤（2)具体为：在步骤（1)制备的混合溶液中，加入10 y L的(：11304溶 液和240 y L抗坏血酸钠溶液，培养，利用ssDNA上的探针部分会和HBV基因碱基互补配对， 阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的G-四连体之间的形成完整的G-四连体，从而不能产 生光诱导电子转移作用的原理，制备得到"关闭"的荧光生物传感器。 进一步的，步骤（2)中所述培养，为20°C培养5min。 进一步的，步骤（2)中所述CuS04溶液浓度为10mM、所述抗坏血酸钠溶液浓度为 100mM 〇 本专利技术提供的一种荧光生物传感器的应用，检测HBV基因的应用。 进一步的，检测HBV基因的应用，具体为：利用制备的荧光生物传感器，不同浓度 的HBV基因荧光强度不同，构建线性关系，实现了对荧光生物传感器灵敏性、特异性的检 测 。 本专利技术提供的无标记的携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光与目 标调节的光诱导电子转移构建的荧光生物传感器，可应用于HBV基因的检测。本专利技术使用 携带聚胸腺嘧啶单链DNA为模板的铜纳米粒子发光作用，利用G-四连体和铜纳米粒子之间 产生光诱导电子转移使铜纳米粒子的发光产生猝灭的现象，制备出基于携带胸腺嘧啶DNA 为模板的铜纳米粒子与光诱导电子转移体系构建荧光传感器，利用目标（HBV基因）和探针 结合形成结构紧凑的体系拉远G-四连体和铜纳米粒子之间距离的原理，实现了对HBV基因 灵敏性、特异性的检测。 与现有技术相比，本专利技术提供的荧光传感器的制备方法，使用的是无标记的DNA， 操作简单，成本很低，避免任何化学标记和修饰。通过G-四连体和铜纳米粒子之间的光诱 导电子转移作用，能够制备出检测HBV基因的传感器。结果显示此传感器对HBV基因1到 500mM有灵敏的检测，且具有操作简单，灵敏度高，检测限低。【附图说明】 图1A为实施例1制备的发荧光的Cu NPs和G-四连体荧光猝灭示意图； 图1B为ssDNA/铜纳米粒子和G-四连体在目标调节下光诱导电子转移检测HBV 基因的不意图； 图2A为ssDNA/铜纳米粒子的紫外吸收可见图； 图2B为ssDNA/铜纳米粒子的荧光发射光谱； 图2C为荧光发射光谱对应时间关系； 图2D为ssDNA/铜纳米粒子的透射电镜； 图2E为ssDNA/铜纳米粒子的透射电镜结果的统计； 图3A为PolyT30/铜纳米粒子（a)在加入hemin(b)和加入G4(c)及共同加入这 两种物质（d)的猝灭现象； 图3B根据图3A构建的柱状图； 图4A为血晶素的紫外可见吸收光谱； 图4B为在血晶素存在的情况下，polyT30/铜纳米粒子和富鸟嘌呤序列的DNA的 可见吸收光谱； 图4C polyT30/铜纳米粒子/玻碳电极在磷酸缓冲溶液（PBS)里的循环伏安（CV) 图； 图4D生成后的辣根过氧化物酶/玻碳电极在磷酸缓冲溶液（PBS)里的循环伏安 (CV)图； 图4E为polyT30/铜纳米粒子在没有（a)和有富鸟嘌呤序列的DNA和血晶素（b) 存在时的荧光寿命； 图5A为在形成G-四连体以后ssDNA/铜纳米粒子的荧光猝灭了（b)，在形成G-四 连体之前加入HBV基因荧光没有猝灭（a)，若在形成G-四连体之后加入HBV基因（d)的荧 光强度。 图5B为电化学研究，关于：ssDNA/铜纳米粒子没有加入HBV基因后，加入G4和 hemin形成了形成具有辣根过氧化酶的催化过氧化氢性质（b)和加入HBV基因阻碍G-四连 体的形成因而无催化过氧化氢的性质（a); 图6A为不同浓度HBV基因对应荧光光谱； 图6B为不同浓度HBV基因对应荧光强度； 图6C为荧光强度与不同HBV基因浓度线性关系； 图6D为选择性的检测（在完全互补配对和1错配2错配3错配本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)、将ssDNA溶液加入缓冲溶液中、然后加入HBV基因溶液，一段时间后，加入hemin溶液和KCl溶液，培养，得到混合溶液；(2)、在步骤(1)制备的混合溶液中，加入CuSO4溶液和抗坏血酸钠溶液，培养10分钟，利用ssDNA上的探针和HBV基因碱基互补配对，阻碍ssDNA头尾设计成的一半序列的G‑四连体之间的形成完整的G‑四连体，从而不能产生光诱导电子转移作用的原理，制备得到“关闭”的荧光生物传感器。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王广凤，万靖，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34