电穿孔用缓冲溶液及上述溶液的使用方法技术

本发明专利技术涉及一种悬浮动物细胞或人的细胞和溶解生物活性分子的缓冲液，以便使用电流将所述生物活性分子引入细胞中，和使用电流和缓冲溶液将生物活性分子引入动物细胞或人的细胞中的方法。在２５℃，ｐＨ值从ｐＨ７至ｐＨ８之间变化时，发明专利技术的缓冲溶液的缓冲能力至少为２０ｍｍｏｌ＊ｌ↑［－１］＊ｐＨ↑［－１］，离子强度至少为２００ｍｍｏｌ＊ｌ↑［－１］。在相应的方法中使用这种类型的缓冲溶液能将生物活性分子以高度的转染效率同时又能以低细胞死亡率引入动物细胞及人的细胞中。在所述缓冲溶液中可以成功地转染不同的细胞类型，特别是具有低活性的静止与活跃的分裂细胞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种悬浮动物细胞或人的细胞和溶解生物活性分子的缓冲液，以便使用电流将所述生物活性分子引入细胞中和使用电流将生物活性分子引入动物细胞或人的细胞中的方法，包括缓冲溶液的使用。
技术介绍
将生物活性分子，例如DNA，RNA或蛋白质引入活细胞中是研究这些分子的生物功能的重要手段。将外来分子引入细胞的优选方法是电穿孔法，这种方法与其它方法不同，它通过转移试剂只对靶细胞的生物结构产生轻微的永久变化。电穿孔过程中，通过短暂电流将外来分子从水溶液引入细胞中，其中，在短暂电脉冲作用下可以使细胞膜被外来分子渗透。由于细胞膜中形成了短暂的“小孔”，如果需要的话，最初进入细胞质的生物活性分子已经能在细胞质中产生有待研究的作用。然而在将DNA引入真核细胞的情况中，DNA必须进入细胞核，这样才能表达遗传信息。在分裂细胞的情况中，这可能在细胞分裂期间发生，其中，核膜暂时溶解后，DNA被动地进入细胞核。然而在研究静态或弱分裂细胞例如原代动物细胞时，DNA不会以这种方式进入细胞核，因此这里不能使用相应的方法或者至少使用相应的方法是十分费力的。而且，特别是在将DNA引入动物细胞中时，所谓的转染，由于细胞的不稳定性，经常会发生特殊的问题，这是由于细胞的存活率是影响转染效率的一个重要参数。现有技术水平在过去，经常使用细胞培养基(Anderson等，J.Biochem.Biophys.Meth.22，207)或使用磷酸盐缓冲的盐溶液或HEPES(Potter等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7161；Fromm等(1985)，Nature 319，791)来摄取动物细胞和DNA分子。然而，动物细胞电穿孔期间(Shimizu等(1986)，Med.Immunol.11，105；Riggs等(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，5602)，也使用非缓冲或弱缓冲的甘露糖醇或蔗糖溶液。这种非缓冲或弱缓冲溶液的缺点在于，使用这些溶液会增加细胞死亡率并大大降低转染效率(Yan等(1998)，Bio Techniques24，590)。因此Yan等(1998)使用由100Mm HEPES，137mM NaCl，4mM Na2HPO4和6mM葡萄糖构成的缓冲溶液进行电穿孔。从人的主动脉获得的平滑肌细胞当然可以成功地在这种缓冲溶液中转染，但转染率只有15％，存活率只有10至20％。而且，Yan等使用的缓冲溶液的最佳电压脉冲只能达到500V，因此没有指示说明这种缓冲溶液是否也能用于直接转染入细胞核要求使用较高的电压脉冲。然而，在任何情况下，在这种缓冲溶液中得到的转染率太低，不能满足更高的要求。许多情况中，使用具有低离子强度因而具有低导电率的缓冲溶液来避免由于高电流而产生的细胞损伤。细胞损伤可以在使用具有高导电率的缓冲溶液，尤其是使用较长时间的高电压脉冲的过程中观察到。Friedrich等，1998(Bioelectrochem.and Bioenerg.47，103)证明，由于水的电解，电穿孔过程中的电流会引起电极附近的pH值变化。pH值的变化使从样品池的铝电极中释放细胞毒性Al3+离子，因此增加了细胞死亡率。作者建议缩短脉冲持续时间来提高转染效率。没有给出使用缓冲液发生任何变化的信息。经常在电穿孔缓冲液中加入二价阳离子如Mg2+。镁离子有助于DNA与细胞表面结合，因此提高了转染率。然而，这似乎仅适用于Mg2+浓度达到10mM的情况，因为在较高浓度时，主要产生的是负效应，例如由于DNA分子的电荷的中和作用而导致电泳减弱或电导率增加使缓冲液变热(Xie and Tsong(1993)，Biophys，J.65，1684；Neumann等(1982)，EMBO J.1，841；Klenchin等(1991)，Biophys.J.60，804)。而且已经提出缓冲液的组分应与细胞内的环境相匹配，从而增加细胞的存活率。因此，应使用与细胞质相对应的钾浓度高、钠浓度低的缓冲溶液来防止电穿孔过程中通过细胞膜中形成的小孔进行物质交换时细胞内Na+/K+比率的任何破坏(van den Hoff等(1995)，Methods in Mol.Biol.48，第15章，185-197)。然而，使用场强度高于1300V/cm的脉冲时，检测到转染效率降低。然而，到目前为止所描述的所有缓冲溶液都具有缺点，当使用这些缓冲溶液时得到的转染效率较低和/或缓冲液不适用于静态或弱分裂细胞的电穿孔过程。专利技术的描述因此，本专利技术的目的在于，提供一种能在获得较高转染效率的同时维持低细胞死亡率的电穿孔用缓冲溶液，以及开发一种相应的方法。这种目的可以通过使用本专利技术的缓冲溶液实现，该缓冲溶液在25℃，pH值在7至8之间时，缓冲能力至少为20mmol*1-1*pH-1，离子强度至少为200mmol*l-1。使用这种缓冲溶液能通过电穿孔的方法将生物活性分子引入动物或人的细胞中，转染率可以达到93％，同时细胞死亡率低。在这种缓冲溶液中可以成功地转染各种细胞类型，尤其是静态及弱分裂细胞。而且，这种缓冲溶液能使用场强度至少为2000V/cm的高电压脉冲，这种高电压脉冲能直接将DNA分子转染到原代动物和人的细胞核中。本专利技术的缓冲液具有有利性能的一个决定性因素在于高缓冲能力与高离子强度相结合。缓冲能力β说明由一TPH单位改变缓冲溶液的pH所需的蛋白分解物的数量(β＝dC*dpH-1，其中dC＝加入的酸或碱的量，dpH＝pH值的变化)。溶液的离子强度I可以使用公式I＝0.5∑ci*zi2计算(ci＝以mol/l表示的离子浓度，zi＝离子电荷)。本专利技术中给出的缓冲物质的离子强度使用“Java BufferCalculator”程序(Twigger & Beynon，1998)计算。在此范围中，可根据不同的细胞类型与要求优化缓冲溶液的组分。优选的实施例中，缓冲溶液的缓冲能力在22与80mmol*1-1*pH-1之间，优选40与70mmol*1-1*pH-1之间。离子强度的范围在200与500mmol*1-1之间，优选在250与400mmol*1-1之间则尤为有利。通常，缓冲能力与离子强度之间有一种最佳关系，取决于细胞类型及其它实验条件，这两种参数之间有一种相互作用。另一个优选实施例中，缓冲溶液至少含有10mmol*1-1镁离子(Mg2+)，优选为15至20mmol*1-1镁离子。与迄今为止的发现相反，惊奇地发现，本专利技术的缓冲溶液中，Mg2+即使浓度很高也能增加转染率，转染率的增加程度要远远超过同时轻微提高离子强度所能解释的范围。这种情况中，缓冲液可以含有氯化镁(MgCl2)和/或硫酸镁(MgSO4)。所提供的一个特别有利的实施例中，如果与细胞的细胞质相比，本专利技术的缓冲液具有较低浓度的钾离子(K+)，优选为2至6mmol*1-1K+，以及较高浓度的钠离子(Na+)，优选为100至150mmol*1-1Na+。因此，本专利技术的缓冲液与细胞内Na+/K+比不匹配，而是在这方面存在细胞外比。然而，令人惊讶的是，这种比例对细胞没有负面影响，但是却大大提高了转染率及细胞存活率。作为有利因素，本专利技术的缓冲溶液含有HEPES和/或Na2HPO4/N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于悬浮动物动物或人的细胞和溶解生物活性分子以便使用电流将所述生物活性分子引入细胞中的缓冲溶液，在２５℃，ｐＨ值从ｐＨ７至ｐＨ８变化时，该缓冲溶液的缓冲能力至少为２０ｍｍｏｌ＊ｌ↑［－１］＊ｐＨ↑［－１］，离子强度至少为２００ｍｍｏｌ＊ｌ↑［－１］。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K罗斯曼，H韦森多夫，J赫尔夫里奇，C蒂尔，G里曼，H布罗斯特赫斯，H穆勒哈特曼，M韦格尔，E洛巴赫，M尼克斯，G希本柯特恩，
申请(专利权)人：埃麦克萨有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]