本发明专利技术提供一种由Anti‑CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，步骤如下：将去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE‑PEG2000‑MAL超声溶解后，在蒸馏水中透析得到聚合物胶束溶液；接着离心取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；将DTT、EDTA、Anti‑CA Ⅸ分别溶于PBS缓冲溶液中制成溶液；将EDTA溶液和DTT溶液加入anti‑CA Ⅸ溶液中，静置后加入乙酸乙酯萃取得到经还原的Anti‑CA Ⅸ溶液；将去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成溶液，取溶液和经还原的Anti‑CA Ⅸ溶液置于试管中，孵化即得胶束纳米粒。本发明专利技术的胶束纳米粒可为新的抗癌药物及应用于临床提供实验依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物制剂领域，尤其涉及一种由Anti-CAⅨ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法。
技术介绍
CarbonicAntibodyⅨ是碳酸酐酶-9(carbonicanhydraseIX)的抗体。碳酸酐酶-9是一个内生性乏氧标志，在很多乏氧肿瘤中有过表达，近年来对它的研究发现，碳酸酐酶-9的表达与非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存期、肿瘤侵袭性等因素相关,其高表达可以作为预后不良的预测因素。碳酸酐酶-9可以作为治疗的靶点，其抗体CarbonicAntibodyⅨ已经被发现具有抗肿瘤作用，当与其它纳米制剂接合时，还可以将纳米粒靶向至碳酸酐酶-9表达的肿瘤区域，提高靶向药物的主动靶向性。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-PolyethyleneGlycol-Maleimide,DSPE-PEG2000-MAL）三嵌段共聚物是一类优异的生物医药材料，具有良好的生物相容性、可降解性、温敏性和易控等特性，可形成PEG在外、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺在内的核-壳结构。亲水性的PEG壳层，可改善其作为载体的生物相容性，抑制单核巨噬细胞的吸收和清除行为，从而延长药物的循环时间，影响药物的药代动力学和生物分布。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和马来酰亚胺形成的酯链端基处于核心，可溶解脂溶性物质，将其包裹于核内，增加其水溶性。因而DSPE-PEG-MAL共聚物已用作多种药物或抗体的载体。去甲斑蝥素（Norcantharidin,NCTD）是由鞘翅目芫菁科昆虫，即南方大斑蝥MylabrisphalerataPallas或黄黑小斑蝥MylabriscichoriiLinnaeus的抗癌有效成分斑蝥素去除1，2位甲基而得得小分子化合物，分子式为C8H8O4。研究表明，去甲斑蝥素通过抑制肿瘤细胞的增值，诱导细胞凋亡以及阻止细胞迁移运动等机制，发挥较强的抗肿瘤活性，且抑瘤谱广，对肺癌、肝癌、直肠癌等均有效，另外，NCTD具有刺激骨髓升高白细胞的作用，保护肝细胞，调节免疫等功能，这与多数抗癌药物骨髓抑制的不良反应相比，具有一定的优势。
技术实现思路
解决的技术问题：针对传统去甲斑蝥素制剂在临床应用上的缺陷，本专利技术提供一种由Anti-CAⅨ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，该制备方法得到的去甲斑蝥素胶束纳米粒，能够充分发挥去甲斑蝥素的抗肿瘤活性，进一步促进和推广去甲基斑蝥素在人肺腺癌治疗中的应用。技术方案：一种由Anti-CAⅨ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，制备步骤如下：第一步：将去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，封口，在蒸馏水中透析后得到聚合物胶束溶液，所述聚合物胶束溶液中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL的重量比为1:190～240:20～21；第二步：将聚合物胶束溶液在4000r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；第三步：将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CAⅨ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CAⅨ溶液；第四步：将EDTA溶液和DTT溶液加入anti-CAⅨ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取得到经过还原的Anti-CAⅨ溶液，其中EDTA溶液、DTT溶液和Anti-CAⅨ溶液的体积比为1:5:50，每次加入的乙酸乙酯的体积与anti-CAⅨ溶液的体积比为4:1；第五步：将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为（5～20）mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti-CAⅨ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti-CAⅨ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒，其中去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti-CAⅨ溶液的体积比为1:1。上述所述的第一步中逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中的速度为每隔10s加入1滴。上述所述的第一步中在蒸馏水中透析的具体步骤为在1000mL的蒸馏水中透析24h，每4h换一次水。上述所述的第一步中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL的重量比为1:200:20。上述所述的第四步中萃取的具体步骤是加入乙酸乙酯萃取5次，每次放置10min后用移液枪去除上层乙酸乙酯，同时除去游离DTT。有益效果：本专利技术提供的一种由Anti-CAⅨ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，该制备方法将去甲斑蝥素制成由CarbonicAntibodyⅨ（Anti-CAⅨ）修饰的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（DSPE-PEG-MAL）聚合物胶束纳米粒，改善了水溶性，增加了体内外稳定性，增强了主动靶向性，降低了毒副作用，可用来开发NCTD新剂型，为新的抗癌药物及应用于临床提供实验依据。附图说明图1为本专利技术的外抗肿瘤活性研究实验中的细胞生存率-药物浓度柱状图；图2为本专利技术的体内抑瘤实验中的各组移植瘤生长曲线图。具体实施方式以下实施例中所使用的去甲斑蝥素原料药购自南京泽朗医药科技有限公司，其纯度大于98%，批号为20141206；大豆卵磷脂购自美国AvantiPolarLipids公司；DSPE-PEG2000-MAL购自美国Avanti公司；DTT购自美国sigma公司；EDTA购自美国sigma公司；Anti-CAⅨ购自美国abcam公司；透析袋的截留相对分子质量为3500，Φ16mm。实施例1一种由Anti-CAⅨ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备步骤如下：将5mg去甲斑蝥素、1000mg大豆卵磷脂和100mgDSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，以每隔10秒加入1滴的速度逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，封口，在1000mL的蒸馏水透析24h，每4h换一次水，最后将制得的聚合物胶束溶液在4000r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CAⅨ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CAⅨ溶液，将4μLEDTA溶液和20μLDTT溶液加入200μLanti-CAⅨ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取5次，每次加入800μL，每次放置10min后用移液枪去除上层乙酸乙酯，同时除去游离DTT，得到经过还原的Anti-CAⅨ溶液；将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为10mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取200μL去甲斑蝥素纳米胶束溶液和200μL经过还原的Anti-CAⅨ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti-CAⅨ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒。实施例2一种由Anti-CAⅨ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备步骤如下：将10mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种由Anti‑CA Ⅸ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于制备步骤如下：第一步：将去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE‑PEG2000‑MAL用乙醇超声溶解后，逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，所述透析袋的截留相对分子质量3500，在蒸馏水中透析后得到聚合物胶束溶液，所述聚合物胶束溶液中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE‑PEG2000‑MAL的重量比为1:190～240:20～21；第二步：将聚合物胶束溶液在4000 r·min‑1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；第三步：将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800 mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500 mmol/L的EDTA溶液；将Anti‑CA Ⅸ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti‑CA Ⅸ溶液；第四步：将EDTA溶液和DTT溶液加入anti‑CA Ⅸ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取得到经过还原的Anti‑CA Ⅸ溶液，其中EDTA溶液、DTT溶液和Anti‑CA Ⅸ溶液的体积比为1:5:50，每次加入的乙酸乙酯的体积与anti‑CA Ⅸ溶液的体积比为4:1；第五步：将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为（5～20）mg·mL‑1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti‑CA Ⅸ溶液置于一个试管中，室温条件下孵化12h，即得由Anti‑CA Ⅸ修饰去甲斑蝥素胶束纳米粒，其中去甲斑蝥素纳米胶束溶液和经过还原的Anti‑CA Ⅸ溶液的体积比为1:1。...
【技术特征摘要】
1.一种由Anti-CAⅨ修饰的去甲斑蝥素胶束纳米粒的制备方法，其特征在于制备步骤如下：第一步：将去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL用乙醇超声溶解后，逐滴加入磁力搅拌的蒸馏水中，挥发30min，倒入透析袋中，所述透析袋的截留相对分子质量3500，在蒸馏水中透析后得到聚合物胶束溶液，所述聚合物胶束溶液中去甲斑蝥素、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000-MAL的重量比为1:190～240:20～21；第二步：将聚合物胶束溶液在4000r·min-1条件下离心30min，取上清液，即得去甲斑蝥素纳米胶束；第三步：将DTT溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为800mmol/L的DTT溶液，将EDTA溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为500mmol/L的EDTA溶液；将Anti-CAⅨ溶于PBS缓冲溶液中制成浓度为0.5mg/mL的Anti-CAⅨ溶液；第四步：将EDTA溶液和DTT溶液加入anti-CAⅨ溶液中，在室温下静置2h，接着加入乙酸乙酯萃取得到经过还原的Anti-CAⅨ溶液，其中EDTA溶液、DTT溶液和Anti-CAⅨ溶液的体积比为1:5:50，每次加入的乙酸乙酯的体积与anti-CAⅨ溶液的体积比为4:1；第五步：将制得的去甲斑蝥素纳米胶束用PBS缓冲溶液稀释成浓度为（5～20）mg·mL-1的去甲斑蝥素纳米胶束溶液，取去甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琳，张雅娟，杨智钧，陆丹玉，
申请(专利权)人：苏州卫生职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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