鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针制造技术

本发明专利技术涉及一种鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针的序列如SEQ.ID.No.1‑SEQ.ID.No.6所示。利用所述引物和探针建立的双重实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于鸭圆环病毒分型检测，为后续科学研究两种鸭圆环病毒基因型致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针
本专利技术属于动物病毒学领域，具体涉及一种鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针。
技术介绍
实时荧光定量PCR方法(Real-timePCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标(molecularBeacon)。TaqMan探针法是指Real-timePCR扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、Cy5、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-timePCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real-timePCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，避免了SYBRGreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛应用于动物传染病学检测领域。此外，不同荧光报告基团(Reporter，R)标记，可同时对单一样本(尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本)开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。鸭圆环病毒(duckcircovirus,DuCV)最早由Hattermann等2003年在番鸭中首次发现。鸭感染DuCV的主要临床表现为感染鸭羽毛凌乱、生长发育不良及体重轻等，对感染鸭的组织病理学研究发现DuCV主要引起鸭法氏囊淋巴细胞减少、萎缩和组织细胞增生等，经原位荧光检测证实DuCV感染鸭的脾脏、胸腺和法氏囊中形成明显的病灶，提示DuCV感染可引起病毒诱导性淋巴组织损伤，从而使感染宿主易并发或继发感染其它病原。DuCV为无囊膜、二十面体对称的病毒，其基因组为单股负链环状DNA，编码两个大的蛋白(ORF-V1和ORF-C1)。研究发现鸭群中流行的DuCV可划分为两大基因型：鸭圆环病毒1型(DuCV-1)和鸭圆环病毒2型(DuCV-2)，其中DuCV-1分支包括DuCV欧洲株、DuCV美洲株、国内部分浙江株、部分山东株和部分福建株，基因组长度为1988bp-1996bp；而DuCV-2分支包括了所有台湾株和部分福建株，DuCV-2分支内DuCV基因组全长均为1988bp。2015年，四川农业大学利用感染性克隆技术获得DuCV-GH01株(属于DuCV-2)，病毒对非免疫雏樱桃谷鸭(10d)的致病性，结果发现雏鸭感染GH01株后可见典型的DuCV临床感染症状(如消瘦、羽毛凌乱和体重减轻等)，其胸腺、脾脏、法氏囊、肝脏和肺脏等多脏器出现不同程度的病理损伤，显著引起宿主靶细胞凋亡，造成免疫器官损伤导致鸭免疫抑制。2018年，韩国学者对D11-JW-008株(属于DuCV-1分支)对北京鸭(24d)致病性研究发现，北京鸭感染后其法氏囊可检测到细胞凋亡，但实验组和对照组类似，并未观察到典型的DuCV临床感染症状(如消瘦、羽毛凌乱和体重减轻等)。上述研究表明，DuCV-1和DuCV-2对雏鸭存在致病力强弱差异。目前，尚未见可特异性性对DuCV-1和DuCV-2感染进行鉴别诊断的实时荧光定量引物组和探针组的研究报道，该方法不仅可用于流行病学检测(达到常规PCR检测效果，但敏感度更高)且可对DuCV-1和DuCV-2具体亚型感染情况进行精准定量的同时进行精准区分不同感染型。本专利技术的用于鸭圆环病毒1型和2型鉴别诊断的引物组和探针组，为后续开展DuCV-1和DuCV-2型间致病机理差异和开展型特异性流行病学调查奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，建立能够同时对鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型进行检测的方法，该方法不仅可用于流行病学检测且可对DuCV-1和DuCV-2具体亚型感染情况进行精准定量的同时进行精准区分不同感染型，为后续开展DuCV-1和DuCV-2型间致病机理差异和开展型特异性流行病学调查奠定基础，同时填补尚未见可特异性性对DuCV-1和DuCV-2感染进行鉴别诊断的实时荧光定量引物组和探针组研究报道的空白。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，包括如下：用于检测鸭圆环病毒1型：上游引物DuCV-1-F：5’-GACTGGCTCACCAACTCGAAG-3’，下游引物DuCV-1-R：5’-TTCCTGAACCTTCGAAGTAACGC-3’；探针DuCV-1-probe：5’-AGGCTCTTCCTCCCAGCGACTCCTCAA-3’；用于检测鸭圆环病毒2型：上游引物DuCV-2-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’，下游引物DuCV-2-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’；探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’；其中，探针DuCV-1-probe的5’-端标记荧光报告基团Cy5，3’-端标记荧光淬灭基团BHQ2；探针DuCV-2-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记MGB；K＝G/T，R＝A/G，V＝A/C/G，S＝C/G。利用所述引物和探针进行鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测时，以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系以及双重TaqMan实时荧光定量PCR反应条件进行实时荧光定量PCR反应，实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，特异性的对鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2进行检测；其中，优化后的双重Ta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针包括如下：/n用于检测鸭圆环病毒1型：/n上游引物DuCV-1-F：5’-GACTGGCTCACCAACTCGAAG-3’/n下游引物DuCV-1-R：5’-TTCCTGAACCTTCGAAGTAACGC-3’/n探针DuCV-1-probe：5’-AGGCTCTTCCTCCCAGCGACTCCTCAA-3’/n用于检测鸭圆环病毒2型：/n上游引物DuCV-2-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’/n下游引物DuCV-2-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’/n探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’/n其中，探针DuCV-1-probe的5’-端标记荧光报告基团Cy5，3’-端标记荧光淬灭基团BHQ2；探针DuCV-2-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记MGB。/n

【技术特征摘要】
1.鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针包括如下：
用于检测鸭圆环病毒1型：
上游引物DuCV-1-F：5’-GACTGGCTCACCAACTCGAAG-3’
下游引物DuCV-1-R：5’-TTCCTGAACCTTCGAAGTAACGC-3’
探针DuCV-1-probe：5’-AGGCTCTTCCTCCCAGCGACTCCTCAA-3’
用于检测鸭圆环病毒2型：
上游引物DuCV-2-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’
下游引物DuCV-2-R：5’-A...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠腾，万春和，傅光华，黄瑜，程龙飞，施少华，陈红梅，傅秋玲，刘荣昌，陈珍，朱春华，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35