确定荧光标记的位置的方法技术

本发明专利技术描述以高空间分辨率确定试样（４）中荧光标记的位置的方法。为此，用激励光束（１１）照射试样（４），同时用粒子束（３）扫描试样（４）。扫描时，标记被粒子束（３）碰撞，并被破坏，这样被碰撞的标记不再发出荧光辐射。这就导致荧光辐射通量下降。检测这种下降。由于在标记被破坏的瞬间粒子束（３）相对于试样的位置是已知的，因此也就可以知道试样中标记的位置。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及确定在待研究的试样中可用辐射激励的标记的位置的方法，所述方法包括-在试样中设置标记；-用第一辐射束照射试样，作为照射的结果在试样中形成激励区，激励区中的标记被激励；-检测标记响应激励而发出的荧光辐射；以及-借助第二辐射束阻止对部分激励区中的荧光辐射的检测。本专利技术还涉及实施所述方法的装置。
技术介绍
从美国专利文本No.6,259,104已知这种方法。在生物学和组织学中，需要确定生物试样中某些分子，例如蛋白质，抗体和核苷酸的位置，以便清楚了解在例如生物试样中某些过程是在何处以及如何发生的。荧光显微镜法(FM)是可以做到这一点的在生物学和组织学中通常采用的方法。为此，将所谓的荧光标记(以下简称为”标记”)附着到重要的分子上。这些标记的特点在于它们非常特别地将它们自已附着到例如某些类型的抗体上，而不附着到其它类型的抗体或其它分子上。而且，这些标记的特点在于它们响应激励(例如光子激励)而发出荧光辐射。这样，通过以下方法确定试样中例如某种类型抗体的位置的可能性提高熬了将标记附着到这种类型的抗体上，随后利用标记发出的荧光辐射来确定标记的位置。应当指出，用于FM的标记可以分类为有机标记和无机标记。有机标记通常包括芳族环。实例有FITC(异硫氰酸荧光素)，TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)和DAPI(bisbenzimide)。许多类型的有机标记都有市售，每一种有其自身的附着特性。这种有机标记如今由例如Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregan，USA销售。这些有机标记的一个典型特性就是它们的寿命有限在光化学反应的影响下，这种标记的寿命限于例如105个发射的光子。这对于标记可被激励的时间来说就很重要。这一点以下再作说明。此外，这些标记中的荧光作用会受环境的影响，例如它们所在的试样中的酸度(pH)、温度、溶剂的存在等等。无机标记含有一种无机材料例如CdSe的纳米晶体，其直径从几个纳米到数十纳米，这种纳米晶体能显示荧光。将这种纳米晶体结合到有机反应基上，有机反应基将标记附着到待加标记的分子(例如蛋白质)上并且确定了标记的具体附着特性。这类无机标记如今由例如Biocrystal Ltd.，Westerville，Ohio，USA销售。无机标记的特点是比有机标记的寿命长得多且对环境影响的敏感性较低。在传统FM的情况下，标记利用光束(例如聚焦的激光束)来照射其中存在荧光标记的试样。在被照射区，即所谓激励区中的标记因此被激励，并对此激励作出响应而发出荧光辐射通量。通过检测是否对激励作出响应而发出荧光辐射，就可以确定标记是否位于激励区。这种方法中的空间分辨率由光束焦点的大小确定。一般来说，所述焦点不会小于所采用的光的波长。所采用的波长不能自由选择，因为只有在给定波段的波长内的光才会激励某种类型的标记，结果，传统FM的空间分辨率限于大约500nm。在FM的用户中，希望继续降低FM的空间分辨率，最好降到分子等级，即几个纳米。在所述专利文本中，说明了一种方法，相对于传统FM而言可以提高分辨率。利用第一辐射束短时间地照射试样，在试样中形成激励区，然后第二辐射束阻止对荧光辐射的检测。第一辐射束是激光束，具有适合于激励标记的颜色。第二辐射束由一种或多种激光束组成，具有将标记去激励(“猝熄”)的某种不同(更红些)的颜色。第一辐射束的强度分布应具有中心最大值，而第二辐射束的强度分布应显示中心最小值。去激励最好在激励后数十微微秒内发生。通过将激励区的一部分中的标记去激励，就可以阻止这些标记的荧光辐射通量被检测，因而可以实现仅仅检测一部分激励区中的标记，于是得到较好的空间分辨率。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种方法，通过这种方法可以利用上述美国专利文本所述的方法来获得更好的空间分辨率。为此，按照本专利技术的方法的特征在于-第二辐射束是在试样上扫描的聚焦粒子束；-所述粒子束焦点的截面积小于激励区的截面积；-粒子束中粒子的能量足以由于损坏的结果而降低被粒子冲击的标记所发出的荧光辐射通量；-在通量降低了至少预定阈值的瞬间记录下聚焦粒子束相对于试样的位置。对激励作出响应，从试样中发射出荧光辐射通量。所述通量是由位于激励区中的一个或多个标记产生的。如果因激励而产生的通量降低了至少预定的阈值，这必定是因为激励区中的标记被破坏。本专利技术基于以下概念，即，通过有意地造成对标记的破坏，通过测定辐射通量因破坏而降低的瞬间粒子束位于何处，来确定标记的位置。可以通过利用聚焦粒子束射击标记来实现这种有意的破坏。聚焦粒子束的产生是已知技术，并且在例如聚焦离子束(FIB)装置、扫描电子显微镜(SEM)装置和环境扫描电子显微镜(ESEM)装置中都已采用。这些装置可以将粒子束聚焦到试样上，粒子束焦点的截面积例如为1nm，并可使所述射束在试样上扫描。在这些类型的装置中，粒子束中粒子能量一般可在从小于200eV到大于20keV的范围内调节。所以，利用这些装置就有可能产生其能量足以破坏标记的粒子。应当指出，所需的破坏不仅会通过标记和聚焦粒子束中粒子的相互作用而发生，也会因标记与二次粒子(例如x射线光子和二次电子，系由相互作用区中的聚焦束所引发的)的相互作用而发生。结果，甚至在距聚焦束有一定距离处标记也可能被破坏，导致位置的测定不甚精确。电子显微镜领域的专业技术人员已知，通过适当选择粒子的能量可将相互作用区的尺寸保持在足够小的范围内。在按照本专利技术的方法的实施例中，激励是通过光子束产生的。通过用光子照射试样，标记被激励，随后标记对激励作出响应发射光子。这种照射可以用激光束，也可以用具有宽带频谱的光束(“白光”)进行。应当指出，使用白光对于同时检测数种类型的标记特别有吸引力，因为各种标记不仅它们所附着的分子类型(例如抗体)不同，而且它们可被什么颜色的光激励，以及它们所发射的荧光辐射的颜色也都不同。如果试样中有数种类型的标记，本专利技术的方法不仅能用来测定标记的位置，也可测定标记的类型。这是因为，当以下述方式实现用于检测荧光辐射的检测器时，即，对于每种颜色(或换句话说，每种类型的标记)，检测器都能测定所述颜色(所述类型的标记)的荧光辐射通量的下降时，就有可能不仅测定标记的位置，也能测定其类型。在本专利技术方法的另一实施例中，聚焦粒子束是聚焦电子束。电子特别在使有机材料发生化学改变方面非常有效。在例如有机标记发生这种化学改变的情况下，标记就会被破坏而不再发射荧光辐射。在本专利技术方法的又一实施例中，聚焦粒子束是离子束。如专业技术人员已知，能量为数keV的离子具有去除它们所碰撞的材料表面的特性(溅射)。这种溅射发生在试样上，也发生在位于试样中的标记上。所以在使标记产生所需的破坏方面离子也非常有效。使用离子的一个附带优点是原先位于试样深处的标记会缓慢出现在试样表面，随后标记被破坏，其位置即可测定。这样，就有可能对试样中的标记进行三维位置测定。在本专利技术方法的另一实施例中，在利用聚焦粒子束照射时引入气体，以便能够进行蚀刻。将气体与离子束或电子束结合使用以便从试样中去除材料是一种已知技术。此技术应用于例如FIB装置中。在利用聚焦粒子束照射试样时使用此技术，在粒子束扫描试样时试样表面被蚀刻掉。于是，原先位于试样深处的标记会缓慢出现在试样表面，随后标记被破坏，其位置即可测定。这本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定在待研究的试样中可以由辐射激励的标记的位置的方法，所述方法包括：－在所述试样中设置标记；－用第一辐射束照射所述试样，作为照射的结果在所述试样中形成激励区，在所述激励区中的标记被激励；－检测响应所述激励作从标记 发出的荧光辐射；以及－借助第二辐射束阻止检测在部分所述激励区中的荧光辐射，其特征在于：－所述第二辐射束是在所述试样上扫描的聚焦粒子束；－所述粒子束的焦点的截面积小于所述激励区的截面积；－所述粒子束中粒 子的能量足以由于损坏的结果而降低被所述粒子冲击的标记所发出的荧光辐射通量；－在所述通量降低了至少预定阈值的瞬间记录下所述聚焦粒子束相对于所述试样的位置。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：B布伊斯塞，RFM亨德里克斯，
申请(专利权)人：FEI公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]