用于区别朊病毒的肽制造技术

本发明专利技术提供了用于在人和动物中检测朊病毒病的肽。也描述了用于确定朊病毒病的组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
I.背景朊病毒病或传染性海绵状脑病(TSE)已经赢得了科学界的关注，不仅是因为它们向关于传染物特性的传统理念发起了挑战，还因为它们对食品和血液安全造成潜在的严重公共健康威胁。此外，近年来一种新的变体疾病形式vCJD的流行性发生更加强调了疾病在动物与人之间传播的可能性。本专利技术描述了合成肽用于诊断动物和人中的传染性海绵状脑病(TSE)的用途。朊病毒——引起TSE的病原体传染性海绵状脑病(TSE)包括一组对人和动物都有影响的快速发展的神经变性致命疾病。TSE具有包括破坏性痴呆、包括肌阵挛的锥体的和锥体束外的病征、多病灶海绵状变化、星形神经胶质增生(astrogliosis)、淀粉样蛋白斑、神经元丢失、无炎症反应在内的临床和神经病理学特征，并且其特征通常是具有长潜伏期。有人提出，TSE病可能是由“慢病毒”或类病毒引起的(Gajdusek1977)。然而，瘙痒病传染力对辐射、核酸酶以及破坏遗传材料的其它试剂的极端抗性却与“病毒”理论相矛盾。TSE传染物的所有这些“异常”特征使Dr.Stanley Prusiner于1982年提出了“朊病毒”这一概念(Prusiner 1982)。朊病毒(PrP)，其表示无核酸的蛋白感染颗粒，是一种存在于人及动物中的糖蛋白。该蛋白的细胞形式(PrPC)具有两个N-连接糖基化位点以及在C-末端具有一个GPI锚。已经在神经元中最普遍地发现了该蛋白，而且，在非常低的程度上，也已经在其它比如白细胞、单核细胞和血小板这样的细胞中发现了该蛋白(Holada 2000)。朊病毒蛋白的传染性瘙痒病形式(PrPSc)是其细胞前体的蛋白酶抗性同工型，且主要发现于脑中。在vCJD患者的扁桃体、脾脏和淋巴结中也已发现了更低水平的PrPSc(Parizek 2001)。由于Prusiner的“朊病毒”是瘙痒病、并扩展至所有TSE病的传染物这一理念，使得出现了通常被称作朊病毒病、用于描述一类被认为与该蛋白有关的病理学的概念。人朊病毒病已知为克-雅(Creutzfeldt-Jakob)病(CJD)，通常影响老年人。根据疾病的表型，大多数CJD为散发性(sCJD)的，而约10％为家族性CJD(fCJD)。只有在最近，才在年轻的成年人中出现了一种新的CJD变体(vCJD)。自1995年以来，已经报道了超过100个病例。朊病毒病影响多种家畜及野生动物物种，常对其表现形式给予独特的命名，例如，绵羊和山羊的瘙痒病(McGowan 1922)、鹿科动物的慢性消耗性疾病(CWD，Williams 1980)和牛的牛海绵状脑病(BSE，或“疯牛”病，Wells 1987)。PrPC和PrPSc的特征根据Prusiner的“只有蛋白(protein only)”假说，导致朊病毒病的传染性病原体是一种蛋白。朊病毒的主要成分似乎是异常折叠的PrP，称作PrPSc(疾病特异性，“瘙痒病”同工型)。据信，PrPSc是从其正常的对应体PrPC通过构象变化形成的(Cohen，1998)。尽管关于转变机制仍然是模糊不清的，但是仍被普遍接受的是在PrPSc存在下，作为底物起作用的正常PrPC发生构象结构变化，并通过一个自我催化过程成为PrPSc，导致PrPSc聚集和淀粉样棒的形成，从而导致细胞死亡(Hope 1986，Horwich 1997)。根据圆二色性和红外光谱学显示的包括蛋白中的β折叠结构在量上的显著提高、以及α螺旋可能在量上的略微减少的关键构象变化最为支持从PrPC到PrPSc的结构变化(Pan 1993，Caughey 1991)。从PrPC到PrPSc的转变效率似乎依赖于两种PrP构象异构体间的序列同源性程度。由于这一独特的机制，朊病毒病易于在相同物种内传播，并且当PrP序列同源性足够时，在物种间传播(Raymond，2000)。因此，如果正确的话，这一假设的朊病毒病传播机制将可能通过这些脑病在动物与人之间的传播而提供引发流行病的潜力。蛋白酶抗性是另一个使PrPSc区别于PrPC的特征。在培养的细胞和脑或来自许多GSS患者的样品中，PrPSc较其细胞前体PrPC要小。即使细胞朊病毒和瘙痒病朊病毒是同一PRNP基因组产物的两种同工型，PrPC也可以被蛋白酶K处理完全降解，而PrPSc只发生有限的消化。该消化产生一种称作PrP 27-30的蛋白形式，其中已经除去了N-末端。PrP 27-30已被假定为以PrPC为宿主的PrPSc复制所需的PrPSc核心。经蛋白酶处理的朊病毒分子，PrP 27-30或PrPres，与瘙痒病传染力密切相关(Gabizon 1988)，这也为PrPSc是一种传染性蛋白提供了又一证明。另一特征，它可能与β折叠结构的显著增加以及相伴随的蛋白酶抗性有关，是所观察到的PrPSc与PrPC间的溶解性差异。尽管PrPC是一种可溶性蛋白，但PrPSc同工型是高度不可溶的。此外，还发现PrPC是经由锚定于膜中的GPI尾部而附着于神经元表面的(Shyng1994)，但是却在被感染细胞的细胞质中发现了PrPres(Taraboulos1990)，它很可能与晚期内体和溶酶体腔结合(Arnold 1995)，而且PrPSc还位于来自感染脑的富集级分的无定形聚集体中(Meyer 1986).存在表明瘙痒病传染力与PrP 27-30间的紧密关联的增多的证据。甚至在最纯的样品中，估计的PrP分子与传染性单位的比率也是～104至105(Horwich 1997，Bolton 2001)。在如此低的传染力水平下，传染力可能需要其它成分、辅因子或共价修饰。对表达嵌合人-小鼠PrPC的小鼠易感性的转基因研究暗示，除PrPC之外存在至少一种可能作为PrPSc形成中的分子侣伴起作用的宿主因子，暂时称作因子X(Telling 1995)。朊病毒病的传染力和传播性朊病毒病是可传播的。动物朊病毒病的传播性已经通过给健康动物接种感染动物的脑匀浆物实验性地建立了很久了，比如将瘙痒病从绵羊接种给绵羊(Cuillé1936)和跨物种接种给山羊(Pattison 1957)，将库鲁症和CJD从人接种给黑猩猩(Gajdusek 1966，Gibbs 1968)。重要突破是瘙痒病向小鼠的成功传播(Chandler 1961)，这通过提供一种实验模型大大促进了TSE研究。近来的牛BSE和人中的CJD新变体(vCJD)的产生，对于BSE而言被认为是由于食物接触了用于动物饲料的瘙痒病绵羊畜体混合物的结果(Brown 1997)，对于vCJD而言是由于食物接触了来自感染有BSE的牛的牛肉的结果(Bruce1997)。vCJD与BSE间的关联还得到从与人最接近的模型BSE-适应的猕猴、以及从用引起BSE和vCJD的试剂接种的近交小鼠的研究获得的神经病理学证据的支持(Lasmézas 1996)。对北美的黑尾鹿和驼鹿中的CWD的流行性扩张尤其关注的是，CWD是否象BSE一样可以传染给可能通过打猎或处理及食用感染的肉而接触该疾病的人类。朊病毒病在人类中的悲剧性无意识传播已经有文件证明，比如通过食用已故同类的脑组织而引起的库鲁症流行，以及通过使用激素、组织移植、以及污染的医疗器械而产生的医原性CJD传播。没有有力的证据表明任一种CJD病与可能具有交叉物种屏障的动物T本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有选自下组的氨基酸序列的肽：　　　　（肽一）ＷＱＰＰＲＡＲＩＧ－Ｋ；（肽二）ＮＷＣＫＲＧＲＫＮＣＫＴＨ；（肽三）ＮＹＫＫＰＫＬＧ；（肽四）ＫＤＦＬＳＩＥＬＶＲＧＲＶＫ；（肽五）ＹＲＧＹＲＧＹＲＧＹＲＧ－Ｋ；（肽六）ＹＲＧＲＹＧＹＫＧＫＹＧＹＲＧ－Ｋ；（肽七）ＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹＳＩＹＶ－ＧＧＫ；（肽八）ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡ－ＧＧＫ；（肽九）ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲ－ＧＳＧＳＫ；（肽十）ＴＩＡＤＲＹＹＲＥＴＡＲ。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：J郑，
申请(专利权)人：奥索临床诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]