本发明专利技术公开了一种测定微量蛋白质含量的计时法。在０．２ｍｏｌ／Ｌ的硫酸溶液中，溴酸钾可氧化酸性铬兰Ｋ褪色，形成兰多尔特（Ｌａｎｄｏｌｔ）反应，而蛋白质对该指示反应产生灵敏的抑制作用，使褪色时间延长，据此建立了一种测定微量蛋白质的动力学分析方法。最大吸收波长为５２６ｎｍ，蛋白质的浓度在０～９０μｇ／１０ｍＬ范围内与褪色所需时间的倒数呈良好的线性关系。它克服了现有技术存在过于复杂等诸多缺点。对于微克级蛋白质含量的检测具有较好的效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用动力学分析快速测定微量蛋白质的方法，可运用于大豆和酸牛奶等食品中蛋白质含量的测定。
技术介绍
蛋白质是生物体的重要组成成分之一，是生命现象的物质基础。蛋白质与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传等密切相关，蛋白质的分析测定是生物化学和其它相关学科以及产品质量检验中最重要的工作。近年来，随着人类基因组计划的提前完成，生物分析技术进入后基因时代，生物大分子(特别是蛋白质和核酸)检测方法的研究，成为生命科学的前沿领域。由于蛋白质在生命科学中的重要性，蛋白质的定量分析法研究就成为一个热点。蛋白质的测定有凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法.Bradford法等。分光光度法测定蛋白质具有设备简单，准确精密和结果直观等特点，已被广泛应用于生物化学和临床化学中蛋白质的测定。但是大多数光度分析法不是过于复杂，就是灵敏度不高，所使用的仪器设备也多是价格昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种灵敏度高、可以对微克级的蛋白质含量进行测定的新型方法，即计时法。构思如下我们发现溴酸钾可以氧化酸性铬兰K褪色，而微量蛋白质对该反应有显著的抑制作用，催化体系和非催化体系之间有较大的色差，在此基础上建立了一种测定微量蛋白质的计时法。本专利技术涉及兰多尔特(Landolt)反应，属于氧化还原反应。以有一定的反应潜伏期为其特征，本质是一种计时法，即固定浓度法。通常是用氧化剂氧化反应物，反应物的浓度缓慢降低，当反应达到一定时间，反应物的浓度急剧改变。存在一个潜伏时间；若体系中含有催化剂，反应时间发生明显的变化。这时催化剂的浓度与反应时间的倒数呈正比关系。具体步骤如下 一、检测试剂的配制(1)酸性铬兰K溶液称取固体酸性铬兰K0.05g，加蒸馏水定容于250mL的容量瓶中，浓度为0.02％。(2)溴酸钾溶液称取固体溴酸钾2.5g，加蒸馏水定容于250mL的容量瓶中，浓度为10.0g/L。(3)牛血清蛋白(BSA)溶液称取0.005g牛血清蛋白溶于100mL的0.5％NaCl溶液中，配制得浓度为50μg/mL的蛋白质溶液；使用时再取10mL于50mL的容量瓶中定容，得浓度为10μg/mL的蛋白质溶液。配制好的蛋白质溶液置于冰箱中保存。(4)硫酸溶液用移液管移取55.6mL的浓硫酸于400mL蒸馏水中，转至500mL容量瓶中定容，浓度为2mol/L。(5)考马斯亮蓝溶液称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％(W/V)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000mL，得0.1g/L的考马斯亮蓝溶液。实验用蒸馏水均为二次蒸馏水。二、检测方法取两支刻度一致的10mL具塞比色管，向其中一支管中加入2.0mL 0.02％的酸性铬兰K溶液，1.0mL 10μg/mL的蛋白质标准溶液，1.0mL 2.0mol/L硫酸溶液，用蒸馏水稀释到接近刻度，然后快速加入0.7mL 10.0g/L的溴酸钾溶液，并用水稀释到刻度，摇匀，迅速放入7200型可见分光光度计中，于波长526nm处以蒸馏水为参比，用1cm的比色皿，测量其吸光度，记录A-t曲线，测量体系至迅速褪色所需时间(另加上溶液混合完全后至开始测量之间的固定时间10s)，作为催化体系，吸光度记为A，反应时间为t；向另一支管中加入2.0mL0.02％的酸性铬兰K，1.0mL 2.0mol/L硫酸溶液作为非催化体系，用蒸馏水稀释到接近刻度，然后快速加入0.7mL 10.0g/L溴酸钾溶液，用水稀释到刻度，摇匀，同样测量体系至迅速褪色所需时间(另加上溶液混合完全后至开始测量之间的固定时间10s)，作为非催化体系，吸光度记为A0，反应时间为t0。计算时间倒数1/t0和1/t，并进一步计算Δ(1/t)＝(1/t0)-(1/t)。含有不同浓度蛋白质的溶液吸光度随时间变化情况示例如图1。三、标准工作曲线的绘制 分别在10mL比色管中加入不同量的蛋白质溶液，再依次加入2.0mL 0.02％的酸性铬蓝K，1.0mL 2.0mol/L的硫酸，0.7mL 10.0g/L的溴酸钾，用蒸馏水稀释至刻度。以蒸馏水为参比，于526nm处进行测量。当吸光度达到0.800时，记下反应时间t0和t。蛋白质用量与时间关系如图2，蛋白质在0～90μg/10mL内与Δ(1/t)呈良好的线形关系Δ(1/t)＝-0.0264C+0.3292，(R＝0.9987)。四、待测蛋白质含量的测定取两支10ml比色管中，一支加入一定量的蛋白质，作为催化体系，另一支不加，作为非催化体系。依次加入2.0ml 0.02％的酸性铬兰K，1.0mL 2.0mol/L的硫酸，0.7mL 10.0g/L的溴酸钾，加入蒸馏水稀释至刻度。以蒸馏水为参比，于526nm处进行测量。当吸光度达到0.800时，记下反应时间t0和t。计算Δ(1/t)。并将其代入式Δ(1/t)＝-0.0264C+0.3292。计算出C。据此求出10mL管中所含蛋白质的量。本专利技术克服了现有技术存在灵敏度低、操作过于复杂、精密度差等诸多缺点，灵敏度高、对于微克级蛋白质含量的检测易于自动化。附图说明图1为含有不同浓度蛋白质的溶液吸光度随时间变化情况图。图2为蛋白质用量与时间关系图。具体实施例方式实施例1将市场上买来的大豆去杂，磨成细粉，准确称取0.01g过60目的豆粉，加10mL、pH＝1.30的缓冲溶液混匀，再加1％NaCl溶液15mL搅拌均匀，提取1.5h后，过滤，用200mL1％NaCl溶液分10次洗涤残渣，滤液定容至1000mL，取适量溶液高速离心10min，取清液1mL，按以下检测方法测定浸提液中蛋白质含量取两支刻度一致的10mL具塞比色管，向其中一支管中加入1.0mL蛋白质提取清液，2.0mL 0.02％的酸性铬兰K溶液，1.0mL 2.0mol/L硫酸溶液，用蒸馏水稀释到接近刻度，然后快速加入0.7mL 10.0g/L的溴酸钾溶液，并用水稀释到刻度，摇匀，迅速放入7200型可见分光光度计中，于波长526nm处以蒸馏水为参比，用1cm的比色皿，测量其吸光度，记录A-t曲线，测量体系至迅速褪色所需时间(另加上溶液混合完全后至开始测量之间的固定时间10s)，作为催化体系，吸光度记为A，反应时间为t；向另一支管中加入2.0mL 0.02％的酸性铬兰K，1.0mL 2.0mol/L硫酸溶液作为非催化体系，用蒸馏水稀释到接近刻度，然后快速加入0.7mL 10.0g/L溴酸钾溶液，用水稀释到刻度，摇匀，同样测量体系至迅速褪色所需时间(另加上溶液混合完全后至开始测量之间的固定时间10s)，作为非催化体系，吸光度记为A0，反应时间为t0。计算时间倒数1/t0和1/t，并进一步计算Δ(1/t)＝(1/t0)-(1/t)。实施例2购置牛奶，将样品放到水浴锅中，温度为20-30℃慢慢摇动混合3-4min在不起泡的情况下，搅动脂肪分离乳液与油层。轻轻搅动，使牛奶明显分离然后放到水浴锅中，使温度上升到35-40℃慢慢混合以帮助脂肪分离。当脂肪分离出来时应迅速调整温度至20℃保温1min，吸取溶液1mL放到离心管中混合。离心分离2min.取1mL置于100mL的容量瓶中，用0.5％的NaCl稀释至刻度。按实施例1的检测方法测定浸提液中蛋白质含量。参考值本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定微量蛋白质的计时法，其特征在于反应属于兰多尔特即Ｌａｎｄｏｌｔ反应，本质是一种计时法，有一定的潜伏期；检测试剂采用酸性铬兰Ｋ溶液、溴酸钾溶液、抗坏血酸溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李建平，熊金平，
申请(专利权)人：桂林工学院，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]
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