用于诊断急性冠状动脉综合征的改进的方法技术

本发明专利技术涉及用于定量测定样品中游离ＰＡＰＰ－Ａ的生物亲和性分析，游离ＰＡＰＰ－Ａ定义为未与主要碱性蛋白的原形（ｐｒｏＭＢＰ）复合的妊娠相关的血浆蛋白Ａ（ＰＡＰＰ－Ａ），其中游离ＰＡＰＰ－Ａ：ｉ）确定为计算出的测量的总ＰＡＰＰ－Ａ和测量的与ｐｒｏＭＢＰ复合的ＰＡＰＰ－Ａ的差，或ｉｉ）通过仅仅测量游离ＰＡＰＰ－Ａ的直接生物亲和性分析而确定。此外，本发明专利技术涉及用游离ＰＡＰＰ－Ａ或一种比值作为标志物来诊断急性冠状动脉综合征的方法，所述比值是：游离ＰＡＰＰ－Ａ／总ＰＡＰＰ－Ａ，游离ＰＡＰＰ－Ａ／与ｐｒｏＭＢＰ复合的ＰＡＰＰ－Ａ，或与ｐｒｏＭＢＰ复合的ＰＡＰＰ－Ａ／总ＰＡＰＰ－Ａ。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于定量测定样品中游离PAPP-A的生物亲和性分析，游离PAPP-A定义为未与主要碱性蛋白的原形(proform)(proMBP)复合的妊娠相关的血浆蛋白A(PAPP-A)。本专利技术进一步涉及以游离PAPP-A作为标志物来诊断人体中急性冠状动脉综合征的方法。
技术介绍
这里使用的旨于解释专利技术背景的出版物及其它材料，特别是一些给出额外实施细节的例子，在此引入作为参考。七十年代初首次鉴定妊娠相关的血浆蛋白A(PAPP-A)是在人晚期妊娠血清中发现的一种高分子量成分(1)。血清中的浓度随著妊娠而增加，直至分娩(2)。PAPP-A最初被表征为一个同四聚体(Homotetramer)(1，3)，但后来证实妊娠期间循环的PAPP-A是与嗜酸性的主要碱性蛋白的原形(proMBP)以2∶2复合的通过二硫键结合的500kDa异四聚体(Heterotetramer)，称作PAPP-A/proMBP(4)。不过，据报道妊娠血清或血浆中也含有痕量(＜1％)未复合的PAPP-A(5)。妊娠中PAPP-A和proMBP二者都产生于胎盘，但主要由不同类型的细胞产生。通过原位杂交分析，发现大部分的PAPP-A是在合胞滋养层中合成，而所有的proMBP是在绒毛外细胞滋养层中合成(6)。通过对克隆的cDNA的分析显示PAPP-A亚基是一个由1547个残基组成的多肽(7)。它含有一个延长的锌结合基序，三个Lin-Notch重复序列和5个短共有重复序列(8)。proMBP是糖基化的蛋白聚糖，它包含90个残基的强酸性原片段和117个残基的高度碱性的MBP成熟形式(9，10)。后者是一种细胞毒性蛋白，存在于嗜酸性白细胞的颗粒中(11)。通过脱颗粒将其从嗜酸性白细胞中释放，在这些细胞的效应物功能中发挥多种作用(12)。尽管在嗜酸性细胞中成熟MBP来源于proMBP的蛋白水解加工，但没有证据显示MBP能产生于PAPP-A/proMBP复合物中的proMBP。就proMBP在PAPP-A/proMBP复合物中的作用而言，有研究显示proMBP在体外起PAPP-A的蛋白酶抑制剂的作用(5，13)。除PAPP-A外，proMBP还与血管紧张素原或补体C3dg形成共价复合物(14)。但是proMBP在其它复合物中的作用仍然不清楚。近来，PAPP-A已被发现在体外是胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白(IGFBP)-4和IGFBP-5的特异性蛋白酶(15，16)。值得一提的是，IGFBP-4的切割是以IGF依赖性方式，而IGFBP-5的切割是以IGF非依赖性方式。不过，PAPP-A在体内的生理功能仍不清楚。胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)主要通过I型IGF受体的介导，在促进众多生物系统的细胞分化和增殖过程中发挥作重要的作用。IGF-I和IGF-II的生物学活性由6种同源的高亲和性IGF结合蛋白调控，这些蛋白与IGF结合，然后阻断IGF与其受体的结合(17)。PAPP-A切割IGFBP-4和IGFBP-5，导致释放结合的IGF，这样就增加了用于与IGF膜受体相互作用的可生物利用的IGF。在临床上，降低的PAPP-A血清水平与唐氏综合征(DS)妊娠有关联(18)。作为一个标志物，PAPP-A目前已被广泛地用来在第一个三月期筛查DS(19)。仅仅在最近，PAPP-A被显示在不稳定动脉粥样硬化斑块(冠状动脉和颈动脉)中存在(20，21)，其循环水平在急性冠状动脉综合征(ACS)患者中升高(20，22)。此外，循环中PAPP-A的存在对于冠状动脉病患者来说还是一个独立的预后分层指标(23)。到目前为止，仍不清楚PAPP-A在斑块中的作用。不过，已经提出，在ACS中观察到的通过IGFBP-4蛋白水解而增加的IGF的生物利用度在冠状动脉粥样硬化的进展及再狭窄中发挥作关键的作用(20，24)。在技术上，循环中的PAPP-A的可测性与PAPP-A的分子结构紧密相关。存在于孕妇血中的PAPP-A的分子结构是否与存在于ACS患者血中的PAPP-A的结构相同是一个非常重要的问题。到目前为止，尚无解决此重要问题的报道。目前用于在上述两种情况下进行PAPP-A测量的所有分析都是基于针对PAPP-A/proMBP复合物的PAPP-A亚基的特异性抗体(20，25，26，27)。从方法学观点上看，该事实使得不能将妊娠中的循环PAPP-A与ACS中的循环PAPP-A区分开来。这里，我们首次提供数据显示妊娠期中循环PAPP-A分子不同于ACS中循环PAPP-A分子。这些发现对于更早期和更特异性地检测循环中的动脉粥样硬化相关的PAPP-A具有重要的临床意义。专利技术目的以及专利技术概述本专利技术的目的是提供更灵敏和更特异的用于早期诊断具有患急性冠状动脉综合征危险的个体的方法。特别是，目的是获得一种诊断方法，其优于通常使用的基于心脏肌钙蛋白I的分析并且优于建议的基于以总PAPP-A作为标志物的分析。因此，一方面，本专利技术涉及一种用于定量测定样品中的游离PAPP-A的生物亲和性分析，游离PAPP-A定义为未与主要碱性蛋白的原形(proMBP)结合的妊娠相关的血浆蛋白A(PAPP-A)。根据本专利技术，游离PAPP-Ai)确定为计算出的测量的总PAPP-A和测量的与proMBP复合的PAPP-A的差，或ii)通过仅仅测量游离PAPP-A的直接生物亲和性分析而确定。另一方面，本专利技术涉及用游离PAPP-A或者一种比值作为标志物来诊断人体中的急性冠状动脉综合征的方法，所述比值是-游离PAPP-A/总PAPP-A，-游离PAPP-A/与proMBP复合的PAPP-A，或-与proMBP复合的PAPP-A/总PAPP-A。第三方法，本专利技术涉及一种结合剂，它与游离PAPP-A结合，但不结合于与proMBP复合的PAPP-A。附图简述附图说明图1显示的是PAPP-A/proMBP复合物的表位示意图。重叠的圆圈表示没有可能的夹心形成。相切的圆圈表示干扰夹心形成。彼此分开的圆圈表示独立的表位。限定仅仅在proMBP上可以接近的表位的单克隆抗体用粗圈表示，而限定PAPP-A上可以接近的表位的单克隆抗体用细圈表示。图2显示的是分析T(分析T＝用于总PAPP-A的分析)和分析C(分析C＝用于与proMBP复合的PAPP-A的分析)的校准曲线和不精密曲线，分析T由两种PAPP-A亚基特异性单克隆抗体构建(A1/B4)，而分析C由一种用于检测的proMBP亚基特异性单克隆抗体和一种用于捕获的PAPP-A亚基特异性单克隆抗体构建(A1/A11)。每一个浓度采用四次重复。具有实心符号的曲线与计数相关，而具有空心符号的曲线与浓度CV相关。图3显示的是SuperoseTM6精密柱(PC3.2/30)上的第一个三月期的血清样品的凝胶过滤。用分析T和分析C检测PAPP-A。PAPP-A/proMBP在甲状腺球蛋白(669kDa)洗脱出来的位置洗脱为单峰。图4显示ACS患者PAPP-A的血清动力学。PAPP-A由分析T和分析C来进行检测。图5显示的是SuperoseTM6精密柱(PC3.2/30)上的四份ACS血清样品和两份第一个三月期的血清样品的凝胶过滤比较。PAPP-A由分析T检测。ACS PAPP-A在脱铁铁蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于定量测定样品中的游离ＰＡＰＰ－Ａ的生物亲和性分析，所述游离ＰＡＰＰ－Ａ定义为未与主要碱性蛋白的原形（ｐｒｏＭＢＰ）结合的妊娠相关血浆蛋白Ａ（ＰＡＰＰ－Ａ），其中游离ＰＡＰＰ－Ａ：　　　　ｉ）确定为计算出的测量的总ＰＡＰＰ－Ａ和测量的与ｐｒｏＭＢＰ复合的ＰＡＰＰ－Ａ的差，或　　　　ｉｉ）通过仅仅测量游离ＰＡＰＰ－Ａ的直接生物亲和性分析而确定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：QP秦，K彼得森，
申请(专利权)人：图尔库大学，
类型：发明
国别省市：FI[芬兰]