一种酮还原酶多肽及其催化制备(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法技术

本发明专利技术涉及一种酮还原酶多肽及其催化制备(S)‑1‑(2‑碘‑5‑氟苯基)乙醇的方法，属于基因工程技术用于制备医药中间体领域。该种酮还原酶能够转化的底物1‑(5‑氟‑2‑碘苯基)乙酮浓度达到200g/L以上，并且产物(S)‑1‑(2‑碘‑5‑氟苯基)乙醇的手性纯度能够达到99％以上，同时底物转化率在99％以上，且在转化过程中未用到有机溶剂。本方案能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶多肽及其催化制备(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法
本专利技术涉及一种医药中间体制备方法，尤其涉及酮还原酶多肽及其催化制备(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法
技术介绍
劳拉替尼(Lorlatinib，CAS号：1454846-35-5)，结构式如式I，是辉瑞公司开发的一种新型、可逆、强效的小分子ALK和ROS1抑制剂，其对ALK已知的耐药突变均具有很强的抑制作用，因而被誉为第3代ALK抑制剂。于2018年11月2日被FDA批准上市，用于治疗ALK阳性的非小细胞肺癌。(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇(CAS号：1454847-96-1)，结构式如式II，是合成劳拉替尼的重要中间体。目前合成(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的主要方法为化学法。专利WO2017148325公开一种化学合成方法，以1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮为原料，使用NaBH4作为催化还原剂，收率可达99％，但是易燃有毒，不适于工业化生产。专利WO2014207606和CN104169286公开一种化学合成方法，以1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮为原料，采用(-)DIPCl作为催化还原剂，需要将反应液冷却至-20℃至-30℃，且操作过程繁琐，收率仅为80％。文献OrganicProcessResearch&Development,21(9),1340-1348；2017报道了采用2,4-二酮葡萄糖酸(DkgA)酶制备(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法，该酶转化底物的浓度仅为66g/L,且该工艺采用了价格相对昂贵的辅酶NADPH，其用量达到底物重量的5％-10％，该方法底物浓度较低，生产成本较高。因此，需要开发一种新的环境友好、收率高且适于工业化应用的技术制备高光学纯度的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法，以满足药物研发与生产方面的市场需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种催化1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮转换为(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的酮还原酶多肽；本专利技术的另一个目的在于提供上述酮还原酶多肽的氨基酸序列；本专利技术的另一个目的在于提供基因序列，此基因序列能够编码上述氨基酸序列的酮还原酶；本专利技术的最终目的在于运用所制备的酮还原酶催化1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮转换为(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇，提高合成效率。本专利技术技术方案采用如下路线：路线中所采用的酮还原酶多肽(KRED)为SEQIDNo.1-10所记载的氨基酸序列；进一步，上述酮还原酶多肽以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮为(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇。进一步，所述酮还原酶多肽催化1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮转化为(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的工艺步骤包括：将1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮、酮还原酶酶粉或含有该种酮还原酶的细胞、辅酶、缓冲液配置成混合溶液，反应得到产物。进一步，反应时间为12～36h，优选为24h。进一步，所述1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮浓度为1～400g/L；酮还原酶酶粉浓度为1～10g/L或含有酮还原酶的细胞的浓度为10～100g/L。进一步，所述含有酮还原酶的细胞选自基因工程改造的大肠杆菌。进一步，所述辅酶选自NAD、NADH、NADP和NADPH中的任意一种或它们的组合。优选NADP+；添加辅酶的浓度为0.02～0.4g/L，优选为0.05～0.10g/L。进一步，酮还原酶以酶粉形式、细胞破碎液或全细胞的形式参与反应，优选以酶粉形式参与反应。进一步，所述缓冲液为磷酸钾缓冲液。进一步，本技术方案中，所述酮还原酶为来源于Flavobacteriumhercynium的突变体，是通过对Flavobacteriumhercynium的酮还原酶的突变体文库进行筛选后得到的。来源于Flavobacteriumhercynium的野生型酮还原酶在NCBI的登记号为WP_089048302.1。并且本专利中所有的氨基酸序列及其可能对应的基因序列均可通过商业化的全基因合成服务制得。进一步，所述酮还原酶多肽由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌为大肠杆菌。本专利技术的有益效果：本专利技术提供一种与现有技术不同的新的酮还原酶及其应用于催化1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮为(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法，并给出了该种酮还原酶所对应的一种基因序列。该种酮还原酶能够转化的底物1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮的浓度高达200g/L，手性纯度值达到99％以上，同时能确保底物转化率在99％以上，使得底物完全、高效的转化成为目标产物，同时不需用到有机溶剂，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。附图说明图1为反应底物1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮的常规HPLC分析谱图。图2为消旋体1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的手性HPLC分析谱图。图3为(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇标准品的手性HPLC分析谱图。图4为实施例6产物的手性HPLC分析谱图。图5为实施例7产物的手性HPLC分析谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本专利技术的内容，但本专利技术的保护范围不限于此。实施例1酮还原酶筛选使用尚科生物医药(上海)有限公司的酮还原酶(KRED)酶库对底物进行反应筛选，反应体系组分如下：0.1MpH6.0磷酸钾缓冲液，底物10g/L，NADP0.2g/L，葡萄糖10g/L，葡萄糖脱氢酶(葡萄糖脱氢酶)5g/L，KRED酶粉10g/L。于30℃反应24h，进行HPLC检测。结果显示，筛选得到的效果最好的酶为来自于Flavobacteriumhercynium的酮还原酶野生型，转化率为50.5％，手性HPLC检测显示产物手性纯度为95％，S构型为优势构型。实施例2构建酮还原酶的单点饱和突变体库为了提高该酶催化的转化率和手性纯度，使用蛋白质工程的手段对该酶进行了定向进化。根据该酮还原酶的蛋白序列，通过计算机模拟结构，与底物进行对接，推测Q147、Y188，S200位点的氨基酸残基可能会与催化作用密切相关，于是对这些位点分别构建饱和突变体库。设计相应的突变引物，利用全质粒PCR扩增反应，扩增出带有突变基因的质粒(载体为pET21a)。接着利用DpnI限制性内切酶对PCR产物进行重组质粒模板消化，再经过纯化之后，转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态，之后将其涂布于含有50ug/LAmp的LB平板上，在37℃的培养箱中倒置培养18h长出单克隆。实施例3突变体库的筛选对Q147位点的突变体文库随机挑选178本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程酮还原酶多肽，该多肽衍生自野生型Flavobacterium hercynium酮还原酶，所述酮还原酶多肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1-10所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种工程酮还原酶多肽，该多肽衍生自野生型Flavobacteriumhercynium酮还原酶，所述酮还原酶多肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1-10所示的氨基酸序列。


2.一种酮还原酶多肽催化制备(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法，其特征在于：1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮在酮还原酶多肽催化作用下，转化为(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇，所述酮还原酶多肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1-10所示的氨基酸序列。


3.如权利要求1或2所述的工程酮还原酶多肽，其特征在于：所述酮还原酶多肽的基因核苷酸序列为SEQIDNo.11-20所示基因序列。


4.如权利要求2所述的酮还原酶多肽催化制备(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法，其特征在于：1-(5-氟-2-碘苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(S)-1-(2-碘-...

【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，包蕾，王波，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31