本发明专利技术实施例公开了一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用，属于生物催化方法及应用技术领域，所述酮还原酶突变体源于Starmerella magnoliae的野生型酮还原酶，能将3S‑1‑氯‑3‑叔丁氧羰基氨基‑4‑苯基‑2‑丁醇转化生成(2S,3S)‑1‑氯‑3‑叔‑丁氧羰基氨基‑4‑苯基‑2‑丁醇，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQ ID NO.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：I54E,S85A,K182V，该酮还原酶突变体的序列为SEQ ID NO.6。本发明专利技术使用醇类用于辅酶循环，底物浓度高达110g/L，底物用量/NADP用量高达1100:1，辅酶循环次数高，有效的扩大了下游应用范围。
【技术实现步骤摘要】
一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用
本专利技术属于生物催化方法及应用
，尤其涉及一种催化活性提高的酮还原酶突变体及其应用。
技术介绍
达芦那韦，又名地瑞那韦，以商品名Prezista出售，是强生公司的一种用于非肽类艾滋病毒蛋白酶抑制剂，美国食品药品管理局(FDA)在2006年批准其上市。2011年美国食品药品管理局(FDA)宣布批准Prezista(达如那韦)的口服混悬液制剂。是全球第二个上市的非肽类蛋白酶抑制剂，是目前世界上主要的抗艾滋病药物之一。(2S,3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇做为制备达芦那韦的关键中间体，目前主要生产工艺有化学合成法和生物法两种，其中生物法可由相应的酮还原酶或微生物全细胞生物转化3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇获得。酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。(R)特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到。旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用。因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。公开报道显示巴西Amanda等人用生物法制备(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(DOI:10.1002/cctc.201403023)，其利用一种Ralstoniasp.来源的RasADH，不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。该方法使用了辅酶NADPH，市场价格昂贵，一定程度上限制了其应用。其底物浓度为10mg/ml折合10g/L且光学纯度仅为90％，无法满足相关医药中间体的制备需求。专利文件JP4746548B2最早提出用生物法制备(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，该专利利用一种新型的羰基還元酵素，不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。该专利同时在中国申请保护并在2011年取得授权(CN1993464B)。后续其他公司如美国Codexis等在酶种类、反应条件、以及辅酶循环等条件进行优化提升，进一步提高生产效率，以期降低条件要求及成本(US8796002)。目前，(2R，3S)醇已可通过酮还原酶突变体实现产业化放大(不低于100g/L底物)，但尚无报道对(2S，3S)醇的工业化生产。另有多种报道尝试利用微生物来源的酮基还原酶制备(2R，3S)或(2S，3S)化合物，如Candidagropengoesseri，Candidasp.，Candidavaccinii，Candidageochares等来源的酮基还原酶。但仍存在低光学纯度(50％-70％)或低转化率等问题，不具有实际生产前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中(2S,3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇酶催化制备过程中酶活低，转化效率低的技术问题。提供一种用于生产达芦那韦中间体的酮还原酶突变体法，技术方案如下：一种酶活提高的酮还原酶突变体，其特征在于，其源于Starmerellamagnoliae的野生型酮还原酶，能将3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，酮还原酶突变体与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQIDNO.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：I54E,S85A,K182V，该酮还原酶突变体的序列为SEQIDNO.6。优选的，所述酮还原酶突变体的酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-15倍。一种多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的编码序列为SEQIDNO.6的酮还原酶重组的多肽。优选的，所述多核苷酸的序列为SEQIDNO.5。一种重组质粒，其特征在于，包括表达载体连接序列为SEQIDNO.5的多核苷。一种宿主细胞，其特征在于，其包含如权利要求5的重组质粒。优选的，所述细胞是一种大肠杆菌。优选的，所述重组质粒的密码子已经为在宿主细胞中表达而进行优化了的密码子。通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：源于Starmerellamagnoliae的野生型酮还原酶，能将3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，酮还原酶突变体与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQIDNO.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：I54E,S85A,K182V，该酮还原酶突变体的序列为SEQIDNO.6。本专利技术整个体系使用单酶催化，使用醇类用于辅酶循环，底物浓度高达110g/L，底物用量/NADP用量高达1100:1，辅酶循环次数高，有效的扩大了下游应用范围。对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产达芦那韦的关键中间体(2S,3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇无副产物产生，纯化方便；底物浓度可达110g/L，约为对照文献的10倍，此外反应溶剂主要为水，三废排放低，绿色环保。附图说明图1为Sma-3的表达质粒图谱；图2为Sma，Sma-3生物转化反应3小时的TLC图谱，从左至右第一列为Sma，第四列为Sma-3，上方条带为底物，下方条带为产物。具体实施方式为了更好的解释本专利技术，下面结合实施例对本专利技术进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。实施例1通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用PrimerPremier(http://primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，得到拼接引物。合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。将配制好的PCR反应体系置于博日XPcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQIDNO.5，命名为Sma-3，其对应的氨基酸序列为SEQIDNO.6本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶活提高的酮还原酶突变体，其特征在于，其源于Starmerella magnoliae的野生型酮还原酶，能将3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，酮还原酶突变体与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQ ID NO.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：I54E,S85A,K182V，该酮还原酶突变体的序列为SEQ ID NO.6。/n
【技术特征摘要】
1.一种酶活提高的酮还原酶突变体，其特征在于，其源于Starmerellamagnoliae的野生型酮还原酶，能将3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2S,3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，酮还原酶突变体与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与SEQIDNO.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：I54E,S85A,K182V，该酮还原酶突变体的序列为SEQIDNO.6。
2.根据权利要求1所述的酶活提高的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-15倍。
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【专利技术属性】
技术研发人员：丁雪峰，王乾，李佳松，
申请(专利权)人：南京朗恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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