钾诊断/测定试剂盒及钾的浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的钾诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定钾浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、色氨酸、辅酶Ａ、色氨酸酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的速度，从而测算出钾的浓度大小。采用本发明专利技术完全可以通过紫外／可见光分析仪器得出所需的测定结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种钾诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定钾浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定

技术介绍
血清钾三个决定性水平的临床意义低于参考值下限，表现低钾血 症，其原因有肾小管疾病，高醛固酮症，胰岛素过多症，代谢性碱中 毒，利尿剂治疗、胰岛素治疗糖尿病酮症时钾离子转移至细胞内等。 高于参考值上限，可能由肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、 肾上腺皮质功能减退等。当血钾高达7. 5 mmol/L或以上时病人将出现 心律失常，应考虑确定适当的治疗方案。血清钾超过10 mmol/L时， 即可发生心室纤颤，心脏停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰 光度计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力 学法。火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测 血清、尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+,是一种发射光谱分析法。测 定方法分为内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般 不采用。现在主要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓 度的内部标准元素锂或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li的浓度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li 比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影 响几乎可忽略不计。化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为 冠醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧 原子有未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结 合不同直径的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清 K， 一般采用普通冠醚阴离子染料进行比色定量。离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器 上进行血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确， 几乎有取代其他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比 电极组合浸泡在待测标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为① 玻璃膜电极，感应材料为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；② 固相膜电极，由难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为 感应膜的电极有C1—电极和F—电极；③液态膜电极，将环氧树脂或内装 聚氯乙稀为感应膜的Ca"电极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述 电极均有一定的寿命，因为电极使用一段时间就会自动老化，有效期 长短不一。原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作 繁杂，误差较大，不及火焰光度法简便。钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐 的方法是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂贵。酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且 抗干扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。 有较好的分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光 度计法成为常规分析项目。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续 监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定钾浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的钾 诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行钾浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因 而可以得到切实的推广应用。本专利技术钾浓度测定方法原理如下色氨酸+水色氨酸酶丙酮酸+氨离子+吲哚 丙酮酸+辅酶入+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶八+还原型辅酶 这种方法利用需要钾离子激活的色氨酸酶(tryptophanase ; EC 4丄99.1 )酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2丄51) 酶促反应速率比色法。色氨酸酶酶解色氨酸反应产生丙酮酸，再通过 (偶)联合丙酮酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收 峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nrn处吸光度上 升的速度，可以测算钾的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术钾诊断/测定 试剂盒较为理想缓冲液100mmol/L稳定剂50 mmol/L辅酶3 mmol/L色氨酸20 mmol/L辅酶A6 mmol/L色氨酸酶12000 U/L丙酮酸脱氢酶16000 U/L本专利技术的钾诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸、辅酶A、色氨酸酶、丙酮酸 脱氢酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、色氨酸、辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、丙酮酸脱氢酶。辅酶、色氨酸、辅酶A、色氨酸酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A。 试剂2缓冲液、色氨酸。 试剂3缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、丙酮酸脱氢酶。 辅酶、色氨酸、辅酶A、色氨酸酶、丙酮酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定钾浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。 具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的钾诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L辅酶 3 mmol/L辅酶A丙酮酸脱氢酶20 mmol/L 6 mmol/L 12000U/L 16000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测钾样品 与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间 大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出钾的浓 度大小。 实施例二本实施例的钾诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲垸—盐酸缓冲液稳定剂辅酶辅酶A100mmol/L 50 mmol/L3 mmol/L 20 mmol/L6 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂丙酮酸脱氢f100 mmol/L 50 mmol/L 12000U/L 16000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶比色法及酶联法的钾的浓度测定方法，其方法原理如下：色氨酸＋水色氨酸酶丙酮酸＋氨离子＋吲哚丙酮酸＋辅酶Ａ＋辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳＋乙酰辅酶Ａ＋还原型辅酶将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的速度，测算出钾的浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]