钾诊断/测定试剂盒及钾浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的钾诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定钾浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、磷酸烯醇式丙酮酸、腺苷二磷酸、氨离子、丙酮酸激酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在４００－７００ｎｍ波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出钾浓度的大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种钾诊断/测定试剂盒，同时本专利技术还涉及测定钾浓度的 方法，属于医学/食品/环境检验测定

技术介绍
血清钾三个决定性水平的临床意义低于参考值下限，表现低钾血症， 其原因有肾小管疾病，高醛固酮症，胰岛素过多症，代谢性碱中毒，利尿 剂治疗、胰岛素治疗糖尿病酮症时钾离子转移至细胞内等。高于参考值上 限，可能由肾小球疾病、肾功能衰弱、糖尿病酮症中毒、肾上腺皮质功能减退等。当血钾高达7.5mmol/L或以上时病人将出现心律失常，应考虑确 定适当的治疗方案。血清钾超过10 mmol/L时，即可发生心室纤颤，心脏 停搏而死亡。高钾使心脏停跳于舒张期。目前钾测定常用的方法有同位素稀释质谱法、中子活化法、火焰光度 计法、化学测定法、离子选择电极法、原子分光光度法、酶动力学法。火焰光度法1950年开始使用并一直沿用至今的火焰光度法检测血清、 尿液、脑脊液及胸腹水的Na+和K+，是一种发射光谱分析法。测定方法分为 内标准法和外标准法两种。外标准法操作误差较大， 一般不采用。现在主 要使用内部标准法，即标本及标准液采用加进相同浓度的内部标准元素锂 或铯进行测定。操作时，将含锂的溶液作为稀释液，同时测定K、 Na和Li 的浓度，以标本与标准液的Na/Li与K/Li比值，计算Na、 K浓度。由于血清稀释倍数大，血清蛋白质粘性的影响几乎可忽略不计。化学测定法主要利用复环王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦称为冠 醚，均为离子载体进行测定，由于大环结构内有空穴，分子内部氧原子有 未共用电子对可与金属离子结合，根据空穴大小，可选择性结合不同直径 的金属离子，从而可达到测出离子浓度的目的。测定血清K， 一般采用普 通冠醚阴离子染料进行比色定量。离子选择电极法ISE法是采用灵敏的特定专用电极，在专用仪器上进 行血清和尿等体液的K+、 Na+的测定，因标本用量少，快速准确，几乎有取 代其他方法的趋势。其仪器测定原理是离子选择电极与参比电极组合浸泡 在待测标本溶液中，进行检测。目前已有的电极种类为①玻璃膜电极， 感应材料为玻璃薄膜的有pH电极、K+电极和Na+电极；②固相膜电极，由 难溶性金属物质加压成型，以固体膜或单日膜作为感应膜的电极有Cl—电极 和F—电极；③液态膜电极，将环氧树脂或内装聚氯乙稀为感应膜的C,电 极；④用缬氨霉素膜制成的K+电极。上述电极均有一定的寿命，因为电极 使用一段时间就会自动老化，有效期长短不一。原子分光光度法原子分光光度法可用于检测血清K+、 Na+，操作繁杂， 误差较大，不及火焰光度法简便。钾测定的决定性方法是同位素稀释质谱法及中子活化法。WHO推荐的方法是火焰光度计法。目前离子选择电极法应用较为普遍，但是电极成本昂虫 贝°酶测定法和火焰光度计法或离子选择电极法均有较好的一致性，且抗干 扰性强，稳定性好，弥补了生化分析仪不能同时测定钾钠的不足。有较的分析性能，易于自动化，在临床化学分析中必定取代火焰光度计法成为常规分析项目。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法 (Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成tl引嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneiminedye)所导致在400—700nm波长处吸光 度的上升，得以测定钾浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方 法的钾诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行钾浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。本专利技术钾浓度测定方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶化+ 腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶喷嗒胺色原或醌亚胺色原+水这个方法应用需要钾离子激活的丙酮酸激酶(pyruvate kinase ; EC 2.7.1.40)联合丙氨酸脱氢酶(alaninedehydrogenase; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase; EC 1.4.3.19)及过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反应连续监测法。丙酮酸激酶作为作用酶，功能为将磷酸烯 醇式丙酮酸酶解产生丙酮酸。丙氨酸脱氢酶也作为作用酶，它的酶促作用 使丙酮酸产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作为循环酶可以一再将丙氨酸再次变 回丙酮酸，使丙酮酸不断地被重复循环利用；同时不断地重复循环产生过 氧化氢。过氧化物酶(peroxidase ; EC Lll丄7)作为显色酶，通过和过氧 化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通 过可见光分析仪器，在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定) 波长处测定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大小程度/速度，得出氨基酸(氮)浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 如下成分关系的本专利技术钾诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 稳定剂 过氧化物酶 丙酮酸激酶甘氨酸氧化酶磷酸烯醇式丙酮酸腺苷二磷酸100mmol/L 500 mmol/L 30000 U/L 10000 U/L 12000 U/L 12000U/L 6 mmol/L 12 mmol/L 20 mmol/L还原型色原体组合 0.1——20 mmol/L氨离子可以用任何氨盐。所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 ， 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 双甲基苯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的钾浓度测定方法，其方法原理如下：　腺苷二磷酸＋磷酸烯醇式丙酮酸　丙酮酸激酶／Ｋ↑［＋］　腺苷三磷酸＋丙酮酸　丙酮酸＋氨离子＋还原型辅酶　丙氨酸脱氢酶　Ｌ－丙氨酸＋水＋辅酶　丙氨酸＋水＋氧　甘氨酸氧化酶氨离子＋丙酮酸＋过氧化氢　过氧化氢＋还原型色原体组合　过氧化物酶　吲嗒胺色原或醌亚胺色原＋水　将最终反应物置于可见光分析仪下，检测４００－７００ｎｍ处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度／程度，得出钾浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]