金黄色葡萄球菌粘附素功能肽及其编码序列制造技术

本发明专利技术公开了一种奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌粘附素功能肽，编码粘附素蛋白的多核苷酸和经基因工程技术制备粘附素蛋白功能肽的生物学方法；同时还公开了所述金黄色葡萄球菌粘附素蛋白功能肽在相关领域可能的用途。本发明专利技术助于进一步研究金黄色葡萄球菌引发乳腺炎的致病机理和研究相应的疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽医学领域，具体地说，本专利技术涉及新的编码牛源金黄色葡萄球菌粘附 素功能肽的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本专利技术还涉及此多核苷酸和功能多 肽的可能用途和制备。
技术介绍
奶牛乳腺炎(Mastitis)是造成奶牛业生产效率低、成本高的主要原因，全国奶牛 每年因乳腺炎造成的损失达100多亿元。目前己证明引发奶牛乳腺炎的微生物约有150 多种，其中金黄色葡萄球菌感染引发的乳腺炎约占30. 6%—41. 7%。金黄色葡萄球菌感染 破坏乳腺组织，导致受感染乳腺泌乳功能下降或丧失，它还释放毒素导致奶牛急性死亡； 其次，金黄色葡萄球菌具有传染性，常可导致整个牛场乳腺炎蔓延；再者，金黄色葡萄 球菌是人、畜共染病原菌，能通过食物链使人患病，严重危害人类健康。目前，应用抗生素防治金黄色葡萄球菌乳腺炎临床上起到了一定效果，但也带来了 "抗性乳"及耐药菌株等危及人类健康的公共卫生问题，因此，受到越来越多的限制。 接种疫苗预防是一种最为方便、有效和经济的措施，但国内至今还没有一种具有自主知 识产权的金黄色葡萄球菌疫苗可供生产上使用。金黄色葡萄球菌的毒力因子主要包括荚膜多糖、粘附素、溶血素、肠毒素和杀白细 胞素等。金黄色葡萄球菌感染机体首先开始于细菌对宿主细胞的粘附。在所有脊椎动物 的组织和器官的细胞表面存在细胞外基质(ECM)，它除了介导细胞的支持，增殖及调节 基因表达外，更是通过它和各种病原菌的粘附素(细菌表面组分)之间的结合作用，病 原菌才得以粘附并侵袭细胞。金黄色葡萄球菌粘附素归于一个单独的群体，叫做细胞 表面成分识别粘附因子(MSCRAMM)。金黄色葡萄球菌的粘附素除了介导细菌粘附外，还 赋予细菌逃避宿主防御机制的功能，主要是通过粘附素将机体的可溶性ECM(纤连蛋白、 胶原蛋白和纤维蛋白原等)大量结合在细菌的表面，使细菌完全被宿主的ECM包被，从 而不被宿主的免疫系统所识别。几乎所有的金黄色葡萄球菌都具有纤连蛋白结合蛋白(FnBP)，它由两个十分相近 的基因分别编码两个相似的FnBP分子(FnBP A和FnBP B)，这两个基因在革兰氏阳性 菌中相当保守，并且这两种粘附因子具有相同的粘附作用。金葡菌通过表面的粘附素与 宿主的细胞外基质发生特定的相互作用，是细菌感染的先决条件，阻断细菌粘附环节， 细菌就无法定居和繁殖，也不能产生和释放胞外酶和外毒素，就可降低乳腺炎的发病率。 因此基于细菌表面蛋白的粘附机制去研究抗金黄色葡萄球菌疫苗具有广阔的研究前景。经检索，本领域还未见有公开的金黄色葡萄球菌粘附素，因此开发金黄色葡萄球菌 粘附素迫在眉睫，这有助于进一步研究金黄色葡萄球菌引发乳腺炎的致病机理和研究相 应的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供金黄色葡萄球菌粘附素功能肽以及其片段、类似物和衍生物。 本专利技术的另一目的是提供编码所述金黄色葡萄球菌粘附素功能肽及其片段、类似物 和衍生物氨基酸序列的多核苷酸。本专利技术的另一目的是提供制备所述功能肽的方法以及该功能肽和编码序列的用途。 本专利技术以如下技术方案实施完成-采集奶牛急性坏疽型乳腺炎乳样，分离金黄色葡萄球菌，提取DNA作为模板，利用 设计合成的特异性引物对金黄色葡萄球菌进行纤连蛋白连接蛋白A (Fnbp A)功能基因 的PCR扩增，将目的基因回收并连接到T载体，鉴定后进行测序，然后将FnbpA基因 连接到pET32a(+)质粒中，经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞，IPTG诱导后进行 SDS-PAGE分析蛋白质表达情况。亲和层析法分离纯化目的蛋白(金黄色葡萄球菌粘附素 功能肽)。表达产物活性分析与检测。利用基因工程蛋白混合佐剂免疫试验小鼠，通过 i5ZZS4方法检测血清中的抗体，分析表达产物的免疫原性。本专利技术提供的金黄色葡萄球菌粘附素功能肽，其特征在于，它包含SEQ IDN0:2所 示牛源金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白Fnbp的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异 多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNO:2所示牛源 金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白Fnbp的氨基酸序列的多肽。更佳地，该多肽不含信 号肽序列。本专利技术提供的编码金黄色葡萄球菌粘附素功能肽的多核苷酸，其特征在于它包括(a) 编码SEQ IDN0:2所示氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片 段、或其活性衍生物的多核苷酸；或(b) 编码SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多核苷酸；或(c) 与(a)或(b)所述多核苷酸互补的多核苷酸；或(d) 与(a)、 (b)或(c)所述多核苷酸序列有至少80%相同性的核苷酸序列。 较佳地，所述多核苷酸是编码具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多核苷酸。 更佳地，所述多核苷酸是具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列的多核苷酸。 本专利技术提供的载体，其特征在于，所述载体含有如上所述的多核苷酸。 本专利技术提供的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是被如上所述的多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞或是被如上所述的载体转化或转导的宿主细胞。 本专利技术所述金黄色葡萄球菌粘附素功能肽的制备方法，其特征在于，所述方法包含(a) 在适合表达金黄色葡萄球菌粘附素功能肽的条件下，培养权利要求7所述的宿 主细胞；(b) 从培养物中分离出金黄色葡萄球菌粘附素功能月i。本专利技术从奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株扩增出编码粘附素的基因(Fnbp A),与标准株进行核苷酸同源性比较，序列同源性为98%。蛋白诱导表达SDS-PAGE分析 发现在80ku处出现特异性条带，其中包括原核表达载体融合蛋白组氨酸标签20.5ku， 并通过组氨酸标签亲和纯化试剂盒纯化获得了预期蛋白。本专利技术成功地克隆到FnbpA 基因，构建的原核表达质粒/^T-尸/7&在大肠杆菌BL21中获得高效表达，蛋白表达量为 33. 4%,并得到了特定标签纯化的蛋白质。对所表达的基因工程蛋白进行活性检测试验 发现，其具有相应的粘附活性，该基因工程蛋白可以阻止73.24%的金黄色葡萄球菌粘附 到哺乳动物细胞，这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计奠定了良好的基础。本专利技术获得的金黄色葡萄球菌粘附素功能肽具有良好的抗原性，经ELISA法测定抗 体效价。试验小白鼠在免疫后，血清中检测到的特异性抗体效价呈明显上升趋势，在15d 后(二免后第一次采血)时各组的抗体效价呈快速升高，于免疫后28d内各组抗体效价持续升高，抗体效价动态趋势基本相同(如表l数据的抗体效价动态变化曲线所示)。 本专利技术所述金黄色葡萄球菌粘附素功能肽和其编码序列的应用。获得抗体所制备的抗体为能与如上所述的金黄色葡萄球菌粘附素功能肽特异性结 合的抗体。本专利技术的金黄色葡萄球菌粘附素功能肽序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增 反应，或者作为探针用于杂交反应。检测金黄色葡萄球菌粘附素功能肽的试剂盒所述试剂盒含有如上所述的抗体和/ 或能特异性检测金黄色葡萄球菌粘附素功能肽的核酸分子引物。应用上述试剂盒检测样品中是否存在粘附素的方法是将样品与粘附素的特异性抗 体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在金黄色葡萄球 菌粘附素。疫苗组合物以安全有效量的本专利技术的金黄色葡萄球菌粘附素功能肽或其片段再辅 以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金黄色葡萄球菌粘附素功能肽，其特征在于，它包含ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示牛源金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白Ｆｎｂｐ的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宏军，杨少华，王长法，高运东，仲跻峰，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]