对变应原进行定量的方法技术

本发明专利技术提供了一种方法，用于对变应原样品中变应原的绝对量加以定量，所述方法包括下述步骤：ａ）提供已知量的一种或多种变应原校正标准肽，其具有与待定量的变应原中发现的序列相同的氨基酸序列，以及可选地，具有对于待定量的变应原中发现的序列来说独特的氨基酸序列，以及可选地，对所述变应原校正标准肽加以标记，ｂ）降解变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用一种或多种标记试剂对所述肽加以标记，其中，降解的变应原样品中的肽或校正标准肽中至少有一样被标记，如果降解的变应原样品中的肽和变应原校正标准肽这两者都被标记了的话，用于标记变应原校正标准肽的标记试剂与用于标记降解的变应原样品的肽的标记试剂不同，ｃ）通过质量分析，将变应原校正标准肽的量与降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的绝对量加以定量。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对变应原进行定量的领域。
技术介绍
变应原是诱导人类变态性应答和IgE抗体产生的抗原性分子。它 们可用于诊断和治疗变态反应，即，变应原免疫疗法，后者是变应原 疫苗形式的。人类所置身于的致变应性来源材料，例如食品、花粉或 螨虫粪便颗粒天然就作为主要和次要变应原的复杂混合物存在。主要 变应原是对该来源产生变态反应的大多数患者对其有所反应的变应 原。但是，看起来任何蛋白都是可能的变应原，因为随着认知增加， 已鉴定出了越来越多的次要变应原。由于变应原来源的复杂性，首先从源自cDM的核苷酸序列推断出 若千变应原的氨基酸序列。对编码变应原的基因的克隆揭示，大多数 变应原是异质性的，且它们作为异变应原和变体的混合物存在。对同 源变应原和异变应原的氨基酸序列比对显示，可通过恒定和可变区域 序列对它们进行鉴定，和/或可将它们分为恒定和可变区域序列。恒定 区域氨基酸序列对于种类来说是独特的，但是可变区域氨基酸序列则 对每种异变应原来说都是独特的。目前通过使用标准化的天然变应原提取物(其被进一步配制为变 应原疫苗)，来进行传统的变应原特异性免疫疗法和诊断。这些水性 疫苗基于致变应性的天然来源材料，例如树和草的花粉、尘埃螨虫培 养物和动物毛发以及皮屑颗粒。这些天然来源材料的组合物已知会相 当大地变化，该变化取决于收集致变应性来源材料的时间和地点。此 外，还可使用多个种类，将商用变应原疫苗配制为变应原的混合物。对重要变应原内含物和提取物的组成的认知是最终产物再现性、安全和效果的先决条件。生产变应原疫苗的一大挑战在于标准化，即， 确保不同批次具有恒定效力。鉴于原材料是天然来源的，变化相当之 大，因此需要通过基于科学的手段来控制。提取物的组成应当理想地 反映出致变应性来源材料的水可溶组分的组成，因为其是在呼吸道(airways)粘膜表面提取的，并被呈递给人免疫系统。但是，所有提 取物都含有若干变应原，它们针对各患者以不同组合导致总的IgE结 合。因此，理想地，需要从质量和数量两方面对所有组分加以控制， 但是对目前的技术而言，这还无法实现。目前以很多种不同方法来进行标准化，因为每家厂商都有公司独 有的标准化流程。通过SDS-PAGE、等电聚集等技术，以及多种免疫电 泳(QIE)和ELISA技术(使用单克隆抗体和/或多克隆抗体)以及放射 变应原吸附(RAST)或相关技术来进行标准化。 一种最优的不同批次 标准化，例如SQ标准化流程基本上有三个步骤的流程l)通过半定量 免疫电泳技术确保最优的组成以及所有组分之间的恒定比例，2 )通过 定量免疫电泳测定主要变应原组分，以及3)如在MagicLite⑧检验中 测定的那样，来调节总的IgE结合效力。在欧洲，目前所有标准化都是 相对公司内部特有的参考制剂进行的，而在美国，FDA颁布了所有厂商 采用的标准。目前所用的这些技术的所有定量方面都依赖于作为试剂 的抗体，并且因此很脆弱，会随着时间改变。对变应原的复杂混合物中特定疫苗组分的绝对定量并不简单，其 还没有被建立为灵敏的、常规的高通量技术。在食品工业中，用于对食品变应原进行可靠探测和定量的常规高 通量技术也是必要的。因为生产期间意外的交叉污染，可能导致坚果 成为食品的隐藏部分。生产具有和不具有例如坚果的相似食品的公司 在制造不同类型的食品之间清洁生产设备方面可能具有困难。之前生 产的食品中的痕量，例如坚果可能留存于设备上。而经由同样的设备 制造的笫一批没有坚果的食品则将可能含有痕量的坚果。由于坚果或 花生的交叉污染导致变态反应的食品是，例如，巧克力、糖果、饼干、 甜点、糖、油炸圏(donuts)、谷物、奶昔、燕麦条、什锦早餐麦、派、松糕、冰淇淋、烧烤酱。牛奶可能导致对来自乳制品、来自牛奶、 基于牛奶的配方食品或含来自奶的蛋白的婴儿食品的少量奶蛋白的变 应反应。为了避免生产嬰儿食品或嬰儿配方食品期间奶蛋白对奶变应 型幼儿造成的污染，因此需要针对奶变应原的探测和定量方法。为确 保符合食品标签规定以及为了提升对消费者的保护，针对食品变应原 的可靠的探测和定量方法是必需的。已经描述了物理化学方法，例如， 质*，以及免疫学方法。通常的灵敏度、特异性、再现性、精度和准确性标准必须满足。但目前仍存在交叉反应性、矩阵效果(matrix effects )和食品加工方面的问题。当蛋白变性时其生物学活性可能仍 旧保留。生物质谦(MS)首先被用来评估蛋白质和肽的分子量和特性。近 些年来，质谱的发展使得可用于对来自复杂混合物(例如，血浆、细 胞和组织样品)的多种生物分子进行定量的技术出现。早期的定量技 术仅建立蛋白质的相对定量，而更近来的技术则能评估感兴趣的分子 的绝对量。定量技术的迅速发展主要是由于蛋白质组学领域的进展， 特别是对例如健康和疾病状态加以区分以及对针对若干种疾病(例如， 癌症、风湿性关节炎和Alzheimers症)的标志分子加以鉴定的应用的 进展。通过MS进行的这些定量技术的主要优点在于技术的高灵敏度， 其在300 amol至300 fmol样品的范围内。WO 2004/070352公开了一种方法，用于使用同量异位(isobaric) 标记试剂或同重元素标记试剂的组，相对于内部标准对肽进行定量。US 6， 872， 575公开了一种方法，用于对复杂样品混合物中的一种或多种蛋白质进行鉴定，而无须纯化该蛋白或获得其复合的肽记号 (composite peptide signature)。US 6， 864， 089公开了一种方法，用于通过对肽或蛋白样品进行差异同位素标记来定量。用于使用MS技术对蛋白进行定量的其它方法是，例如，AQUA技术， 其使用内部校正肽，这是用掺入的稳定同位素(13C， "N)合成的，以 模拟通过使用例如胰蛋白酶进行酶促消化形成的天然肽(Stemmann 0et al. Cell 2001; 107 (6): 715-26， Gerber SA et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(12): 6940-5 )。另一方法是ICPL (同位素编码的蛋白标记)方法，如Kellermann et al， Proteomics 5， 4-15所述，其中使用例如12(71306-烟碱酸-琥珀 酰亚胺作为ICPL标记。质镨首先被引入变态反应研究领域，以表征天然变应原，包括翻 译后修饰，例如，糖基化情形。还进一步用其来表征重组异变应原和/ 或变体，其中很多已在多种表达系统中表达，所述表达系统例如 ^力er/ca Co/厶户/c力/a尸fl"or/沐^scz7/o7/rz/s表达系统，Johannes et al， J Allergy Clin Immunol, Vol. 110， No. 1(2002)的第131-138页描述了用MS来研究通过PCR克隆鉴定出来的变应原同种型(isoform)的实际表达，在Swoboda et al.， J. Biol Chem，Vol 270， No. 6 (1995)的第2607-2613页中,用液相色镨、MS和cDNA克隆来分析主要的桦树花粉变应原Bet v l的同种型。但是目前对于下述灵敏的方法仍有需求，所述方法是这样的通 过其可对例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，用于对变应原样品中变应原的绝对量加以定量，所述方法包括下述步骤：　　　　ａ）提供已知量的一种或多种变应原校正标准肽，所述标准肽具有与待定量的变应原中发现的序列相同的氨基酸序列，以及可选地，对所述变应原校正标准肽加以标记，　　　　ｂ）降解所述变应原样品，以获得肽的混合物，以及可选地，用一种或多种标记试剂对所述肽加以标记，　　　　其中，降解的所述变应原样品中的肽或所述校正标准肽中至少有一样被标记，如果所述降解的变应原样品中的肽和所述变应原校正标准肽这两者都被标记了的话，用于标记所述变应原校正标准肽的所述标记试剂与用于标记所述降解的变应原样品的肽的所述标记试剂不同，　　　　ｃ）通过质量分析，将所述变应原校正标准肽的量与所述降解的变应原样品中的相应的肽的量关联起来，来对变应原的所述绝对量加以定量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：U塞帕拉，
申请(专利权)人：阿尔克阿贝洛有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]