本发明专利技术发明专利技术了一种定性检测人血清中蟹变应原特异性ＩｇＥ的ＥＬＩＳＡ试剂盒，其组成包括已包被纯化的蟹变应原蛋白的酶标反应板、辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＥ抗体、样品稀释液、ＴＭＢ底物显色液、浓缩洗涤液、终止反应液、阳性对照液和阴性对照液。本发明专利技术的试剂盒的制备工艺中，用于包被酶标反应板的抗原是从中华绒螯蟹组织蛋白中分离纯化的一组具有变应原活性的蛋白质，其分子量分别为２９ＫＤａ、３４ＫＤａ、３５ＫＤａ、４１ＫＤａ、４８ＫＤａ、５３ＫＤａ、６０ＫＤａ、６６ＫＤａ和７６ＫＤａ，以其中的任意１种或１种以上组合作为包被抗原。按本发明专利技术制备的蟹变应原特异性ＩｇＥ检测试剂盒，可应用于临床上蟹类食物过敏症的体外辅助诊断和相关科学研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种定性检测人血清中蟹变应原特异性IgE的酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测试剂盒及其制备方法，筛查和诊断因进食或接触蟹类食物而引起的过敏症。
技术介绍
食物过敏反应是现代社会中常见的一大类疾病，其发生是因进食或接触各种食物 中的变应原而引起的，大都是由IgE介导的I型超敏反应。 食物过敏反应的发病机理主要涉及两方面因素，一是食物变应原的剌激，另一个 是个体的反应性。当食物变应原进入机体后，激活特异性B细胞克隆产生针对该变应原的 特异性IgE，IgE以其Fc段与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的IgE Fc受体(Fc e R)结合，使 机体处于致敏状态。当机体再次受到相同的变应原剌激时，再次进入的变应原与已结合在 肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的特异性IgE结合，引起Fc e R桥联，激活肥大细胞和嗜碱性粒 细胞，通过一系列膜分子行为导致细胞脱颗粒、释放和合成组胺、激肽酶原、前列腺素、白三 烯、血小板活化因子等多种生物活性介质，作用于血管、皮肤、粘膜、腺体等靶器官，引起支 气管平滑肌收縮、血管扩张、毛细血管通透性增加、组织水肿及呼吸道和消化道炎症反应； 导致支气管哮喘，过敏性鼻炎，过敏性胃肠炎，过敏性荨麻疹，严重时可引起过敏性休克。 正常人血清中IgE的量极低，约为5X 10—Smg/ml，用特异性变应原进行检测时一般 呈阴性反应。发生过敏反应的个体血清中IgE含量显著升高，可比正常高出1000 2000 倍，用特异性变应原进行检测时都呈阳性反应。因此，应用变应原作为抗原检测血清中的特 异性IgE，是理想的I型超敏反应的临床诊断指标之一。专利技术内容 本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、方便快速地定性检测人血清中蟹变应原特异性IgE的ELISA检测试剂盒，用以筛查和诊断蟹类食物过敏症。 本专利技术的蟹变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒，其组成包括已包被纯化的蟹变应原蛋白的酶标反应板、酶标记抗体、底物显色液、样品稀释液、阳性对照血清、阴性对照血清、浓縮洗涤液和终止反应液； 其中 包被酶标反应板的蟹变应原蛋白是从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)组织 蛋白中经过分离纯化得到的纯化变应原蛋白，包括分子量为29KDa、34KDa、35KDa、41KDa、 48KDa、53KDa、60KDa、66KDa和76KDa的9种蛋白质，以其中任意1种或1种以上组合包被酶 标反应板作为检测抗原。 酶标记抗体辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgE抗体；底物显色液1. 25mmol/L 3， 3'， 5， 5'-四甲基联苯胺(TMB) 、 12mmol/L过氧化脲、15mmol/L拧檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5. 0-5. 4 ;样品稀释液75mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7. 0-7. 4，含0. 1 % Tween-20、庆大霉素3100u/ml 、0.01%硫柳荥和0. 01 %山梨酸、1 %牛血清白蛋白； 阳性对照血清蟹变应原特异性IgE阳性血清混合物； 阴性对照血清正常人血清混合物； 浓縮洗涤液0. 25mol/L磷酸盐缓冲液，pH7. 2-7. 4，含1% Tween-20、0. 01%硫柳 汞和0. 01%山梨酸；终止反应液:lmol/L H2S04。本专利技术的蟹变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤 (1)包被酶标反应板用纯化的中华绒螯蟹变应原蛋白为抗原包被酶标反应板； (2)封闭酶标反应板用封闭液封闭已包被蟹变应原蛋白的酶标反应板； (3)配制酶标记抗体； (4)配制底物显色液； (5)配制样品稀释液； (6)配制浓縮洗涤液和终止反应液。 本专利技术的蟹变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤 (1)取待检样品、阳性对照血清、阴性对照血清分别加入相应的酶标反应板反应孔 中，37t:孵育30分钟，使待检样品以及阳性对照血清中特异性IgE与包被在酶标反应板反 应孔中的蟹变应原特异性结合； (2)用洗涤液洗涤，除去未结合的杂蛋白和其它物质； (3)于酶标反应板反应孔中加入HRP标记的羊抗人IgE抗体，37。C孵育30分钟，使 HRP标记的羊抗人IgE抗体与已结合在反应孔固相的特异性IgE结合； (4)用洗涤液洗涤，除去未结合的酶标记抗体； (5)于酶标反应板反应孔中加入底物显色液，37t:或室温孵育15分钟，使标记酶 分解底物出现颜色反应； (6)于酶标反应板反应孔中加入终止反应液，终止酶反应后，用酶标仪在450nm波长下测定吸光值。 具体实施方法 下面的实施例将具体说明本专利技术的操作方法，但不能作为对本专利技术的限定。 实施例一 蟹变应原特异性IgE ELISA检测试剂盒的制备。 本试剂盒的制备过程包括如下步骤 1.包被酶标反应板 用包被液(0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9. 5-9. 6)将纯化的中华绒螯蟹的76KDa 变应原蛋白稀释至4 g/ml，于96孔(或48孔)酶标反应板每孔加入50 (变应原蛋白 包被量为200ng/孔)，将加好包被抗原液的酶标反应板置湿盒内，于37t:孵育3小时，然后放置4t:过夜。 次日甩去包被液，用洗涤液洗酶标反应板三次，拍干。 2.封闭酶标反应板 于酶标反应板每孔加入封闭液(含2%脱脂牛奶粉的0. Olmol/L磷酸盐缓冲液， pH 7.4)220iil，置湿盒内，于37t:孵育3小时，然后放置4t:过夜。 次日甩去包被液，用洗涤液洗酶标反应板三次；将酶标反应板真空干燥，装入带有干燥剂的铝箔袋内密封，贮存于4°C 。 3.配制酶标记抗体 用样品稀释液将HRP标记的羊抗人IgE抗体(购自美国KPL公司)稀释为1 : 2500 浓度；分装于小试剂瓶，贮存于4°C。 4.配制底物显色液 底物显色液成分为1.25mmol/L 3， 3'，5， 5'-四甲基联苯胺(TMB) 、 12mmol/L过氧 化脲、15mmol/L柠檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5. 0-5. 4。先按配液总量的80 90 %配制15mmol/L拧檬酸-5mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，调 节pH至5.4 ;准确称取所需量的过氧化脲加入缓冲液内，使完全溶解并充分混匀；准确称取 所需量的TMB用适量乙醇溶解，缓慢加入缓冲液内，充分混匀；最后用蒸馏水定容至配液总 量；分装于小试剂瓶，贮存于4°C。 5.配制样品稀释液 样品稀释液成分为75mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7. 0-7. 4，含0. 1 % Tween-20、庆大 霉素100u/ml、0. 01%硫柳荥和0. 01%山梨酸、1%牛血清白蛋白。 先按配液总量的80 90%配制75mmol/L磷酸盐缓冲液，调节pH至7. 2 ;按所需 量加入庆大霉素(原液8万u/ml或4万u/ml) 、 1 %的硫柳汞和10%的山梨酸，使其终浓度 分别为100u/ml、0. 01%和0. 01%，充分混匀；准确称取所需量的牛血清白蛋白加入缓冲液 内，使完全溶解并充分混匀；按所需量加入Tween-20使其终浓度为0. 1%，充分混匀；最后 用蒸馏水定容至配液总量；分装于小试剂瓶，贮存于4°C。 6.配制浓縮洗涤液 本文档来自技高网...
【技术保护点】
蟹变应原特异性ＩｇＥ的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，其特征在于该试剂盒组成包括： （１）已包被蟹变应原蛋白的酶标反应板； （２）酶标记抗体； （３）底物显色液； （４）阳性对照血清； （５）阴性对照血清； （６）样品稀释液； （７）浓缩洗涤液； （８）终止反应液 其中： 已包被蟹变应原蛋白的酶标反应板：蟹变应原蛋白是从中华绒螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）组织蛋白中经过分离纯化得到的纯化变应原蛋白； 酶标记抗体：辣根过氧化物酶标记的羊抗人ＩｇＥ抗体； 底物显色液：１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ３，３’，５，５’－四甲基联苯胺（ＴＭＢ）、１２ｍｍｏｌ／Ｌ过氧化脲、０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸－０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠缓冲液，ｐＨ５．０－５．４；样品稀释液：０．０７ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液，ｐＨ７．０－７．４，含０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、庆大霉素１００ｕ／ｍｌ、０．０１％硫柳汞和０．０１％山梨酸、１％牛血清白蛋白； 浓缩洗涤液：０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液，ｐＨ７．２－７．４，含１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．０１％硫柳汞和０．０１％山梨酸；终止反应液：１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ↓［２］ＳＯ↓［４］。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈伟，吴兴达，黄海波，邬敏辰，吴静，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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