本发明专利技术公开了一种ｘ－型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其应用。本发明专利技术的ｘ－型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体是由保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２４５６的杂交瘤细胞分泌的。本发明专利技术利用所制备的ｘ－型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体采用间接ＥＬＩＳＡ方法并结合ＳＰＳＳ软件分析，可以对小麦及其近源种中ｘ型高分子量谷蛋白亚基进行高效、准确的鉴定，通过标准曲线对待测谷蛋白亚基进行定量，可以用于小麦的品质预测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体及其应用。
技术介绍
小麦籽粒中的贮藏蛋白是影响小麦加工品质的主要因素。在所有的禾谷类作物 中，仅有小麦可以加工成各种各样的烘烤和蒸煮食品，这主要是由于小麦胚乳中的 贮藏蛋白可以使面粉做成具有延展性和弹性的面团。小麦的贮藏蛋白分为醇溶蛋白 和谷蛋白两种，其中醇溶蛋白主要决定小麦面团的延展性和粘性，而谷蛋白主要决定了面团的弹性。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)的多肽分子研究表明，麦谷蛋白按分子量的大小可以分成两部分高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS，分子量为90-147kD，占谷蛋白的10%左右)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS，分子量为12-60kD，占谷蛋白的90%以上)。研究表明HMW-GS与小麦面包的烘烤品质和面粉的加工品质密切相关，并且不受环境条件的影响，是优质遗传特性的生化标记。普通小麦染色体为六倍体(AABBDD)，从遗传角度讲，高分子量谷 疋6;n7宜ZVfiilicb、^l^t乂7lr i a i d壬n in么启辛k r—i，，-Ai r—i，，一di壬n r—m AV A k的宜忠|_| _!UL^r 乂j 乂j'j'RX;^ d 丄几、丄JJ 1 h 丄u k、同u丄u ii丄、vi丄Li u丄/iHu丄Li 丄 n /vr、 u j因编码，这些位点分别被命名为Glu-Al、 Glu-Bl和Glu-Dl位点。每一位点含有两 个基因， 一个编码较高分子量的x-型亚基，另一个编码较小分子量的y-型亚基， 每一个HMW亚基位点有许多变异(等位亚基)。大量研究表明，同属于x-型亚基的5 亚基和2亚基与烘烤品质的相关性并不相同，其中5亚基与烘烤品质呈正相关，而 2亚基则呈负相关。目前，对小麦胚乳贮藏蛋白的研究方法主要有电泳法、色谱法、流变学特性测 定法、沉淀值测定法等。相比较而言，这些方法各具优势，但不足之处在于或者效 率太低、操作费时；或者需要很多比较昂贵的仪器、难以普及。而且利用上述方法 进行分析时，往往需要较大的样品量，这在育种的早代难以达到。随着免疫学技术 的发展，抗体检测技术已经成为小麦蛋白和品质分析等领域的重要检测技术之一， 越来越多的受到国内外研究者的重视。最近，酶联免疫吸附测定法(ELISA)因其 具有成本低、耗费少、所需样品量少以及样品处理简单等优点，已经开始应用于品 质预测和筛选。利用这种方法测定小麦品质，关键是要制备适宜的抗体，尤其是单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体。本专利技术所提供的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 2456的杂交瘤细胞所分泌的。分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞已于2008年04月15日保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯 路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No. 2456。本专利技术以斯卑尔脱小麦Somiedo为材料，采用电泳法分离纯化x-型高分子量 谷蛋白亚基，并以此为抗原免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术制备了 x-型高分子 量谷蛋白亚基单克隆抗体。本专利技术所提供的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体还可用于制备试剂盒。含 有所述x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术利用所制备的x-型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体采用间接ELISA方 法并结合SPSS软件分析，可以对小麦及其近源种中x-型高分子量谷蛋白亚基进行 高效、准确的鉴定，通过标准曲线对待测x型高分子量谷蛋白亚基进行定量，可以 用于小麦的品质预测。rr/丄rw 、" 口口附图说明图1为纯化后抗原的SDS-PAGE结果图2为单克隆抗体同多个小麦品种的SDS-PAGE及免疫印迹结果具体实施方式实施例1、抗原的制备 1、小麦谷蛋白亚基的提取(1) 称取20mg斯卑尔脱小麦Somiedo (中国国家种质资源库)种子，研碎成粉 末，加入70%乙醇涡旋30min。(2) 室温12， OOOrpm离心5min。(3) 弃去上清，在沉淀中加入600W蛋白提取液(50%体积百分含量的正丙醇， 5%体积百分含量的5-巯基乙醇)，5(TC水浴1小时，其间摇2-3次。(4) 12, 000rpm离心10min，取上清。(5) 加入等体积样品缓冲液(终浓度为O. 125MpH6.8的Tris-HCl， 8% (质量百分含量)SDS， 20% (体积百分含量)甘油，0.002% (质量百分含量)溴酚蓝)，混 合均匀，即得到小麦谷蛋白亚基提取液，4。C保存备用。 2、 HMW-GS的分离纯化(1) 将步骤1得到的小麦谷蛋白亚基提取液经SDS-PAGE (浓縮胶浓度为3. 75%， 分离胶浓度为10%， 20mA稳流电泳18hr)分离后，用考马斯亮蓝染色。(2) 切下82KDa的目的条带，用蛋白脱色液(含终浓度25mM碳酸氢铵，50%体 积百分含量的乙腈)脱色过夜。(3) 将目的条带装入透析袋中，以8-10mA的电流稳流进行水平电泳6-8h。(4) 取出条带凝胶，溶液经聚乙二醇6000浓縮过夜。(5) 蒸馏水透析24小时，其间换透析液3次。(6) PBS缓冲液透析24小时，其间换透析液3次。(7) 收集透析后的HMW-GS。 紫外分光光度计测定上述收集到的HMW-GS在260nm和280nm的吸光值，利用下述公式计算蛋白质的浓度蛋白质浓度(mg/ml) =1. 45 X 0D28。-0. 74 X0D260 。经计算，HMW-GS的浓度为0.321mg/ml，最后获得的HMW-GS的总量为28. 9mg。再利用SDS-PAGE，检测纯化效果。具体检测结果如图1所示。其中，1为纯化后的HMW-GS的SDS-PAGE电泳结果；2为斯卑尔脱小麦Somiedo蛋白提取物的SDS-PAGE电泳结果(图其中箭头所示为纯化的亚基)。结果表明，经纯化的HMW-GS中无其它杂蛋白，蛋白的纯度较高。 实施例2、阳性单克隆杂交瘤细胞系的建立1、 动物免疫选取8-10周龄的健康雌性BALB/c小鼠，初次免疫时，将实施例1纯化 的HMW-GS作为抗原(lOOPg实施例1纯化的HMW-GS溶解于无菌的PBS溶液 中)与等体积的弗式完全佐剂均匀混合后，背部皮下多点注射免疫小鼠。3周后取 相同体积、相同浓度的纯化的x-型高分子量谷蛋白亚基与等体积的弗式不完全佐剂 混合均匀，免疫方法同上。此后，每隔两周加强免疫一次，共免疫四次。最后一次 取50ul抗原原液(浓度为0.321mg/ral)，腹腔注射，加强免疫。2、 检测方法的建立(1)用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将抗原倍比稀释成200ug/ml， lOOwg/ml, 50ug/ml， 25u g/ml禾口 12. g/ml。(2) 用含W(质量百分含量)BSA的PBS缓冲液将四免后的小鼠血清按1:1000， 1:2000， 1:4000， 1: 8000， 1:16000, 1:32000， 1:64000， 1:128000的体积比稀释。(3) 间接ELISA检测方法的建立 将稀释好不同浓度的抗原分别加至酶标板中，100ul/孔，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ｘ－型高分子量谷蛋白亚基单克隆抗体，是由保藏号为ＣＧＭＣＣＮｏ．２４５６的杂交瘤细胞所分泌的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：晏月明，李巧云，祭康敏，
申请(专利权)人：首都师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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