本发明专利技术公开了一种Ｈ５Ｎ１型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，属于属于检验检疫领域。该方法包括如下步骤：（１）制备和纯化Ｈ５Ｎ１型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；（２）制备水溶性羧基化纳米量子点；（３）纳米量子点标记Ｈ５Ｎ１型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；（４）样品测定。本发明专利技术的优点是：纳米量子点应用于Ｈ５Ｎ１型高致病性禽流感检测的诊断方法，该方法快速、稳定、便于高通量检测、条件要求低、操作简便，易于推广，具有操作简单、快速和灵敏度高等特点。该方法的建立将为我国高致病性禽流感的监测和诊断提供了一种有效的手段，在进出口检疫上具有良好的推广和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，更具体说是一种釆用超声乳化 改性制备的量子点标记禽流感病毒单抗或多抗进行检观啲方法，属于检验检疫领域。
技术介绍
禽流行性感冒(简称禽流感，avian influenza, A I)是由A型流感病毒引起的禽类 烈性传染病，被国际兽疫局定为A类传染病，其中H5N1亚型禽流感是近年来爆发的最为 频繁一种高致病性禽流感，给家禽业带来了巨大的经济损失，也威胁着人类的生命健康。 随着我国也发现了人感染禽流感的病例，高致病性禽流感的防控工作尤为重要。禽流感的 控制关键在于建立快速诊断禽流感病毒的方法，而现有的禽流感诊断技术不能满足我国高 致病性禽流感的快速诊断的需要，因此,建立快速诊断禽流感技术已成为我国预防和控制 高致病性禽流感的当务之急。对禽流感的快速检测是控制该病的根本前提。由于禽流感的临床症状和病理变化因感 染禽的种类、龄期、病程长短、并发感染情况及感染毒株力等的不同而有所不同，因此， 禽流感的症状一直依赖于病原的分离鉴定。目前禽流感的诊断的主要是通过病毒分离和血 清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。其中血清学诊断包括琼脂扩散试验 (AGP)、血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、中和试验(NT)、 免疫荧光技术(IFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等六种检测方法。近年来，随着分子 生物学技术的发展，RT-PCR方法也逐渐应用于禽流感的检测。现有技术的不足之处在于1. 病毒的分离鉴定是诊断AI的一种可靠方法，但病毒分离培养耗时长，至少需7d, 不利于快速诊断和免疫程序的合理制定，难以胜任对高致病性AI快速诊断的需要。2. 琼脂扩散(AGP)试验进行病毒抗原性特异性试验，此法虽然简单易行，但敏感性 较差，易出现假阳性。在进行HA实验时，应先出去非特异性非凝集抑制因子。血凝实验(HA)和血凝抑制实验(HI)特异性好，但其过程繁琐费时，但其操作相对繁琐，同时必 须具备一定血凝效价的标准病毒和新鲜制备的红细胞。血清学检査对最后确诊有回顾性的 诊断价值，一般只能在发病23周甚至更长时间才能有抗体阳性出现。神经氨酸酶试验(NI) 试验比HI试验复杂得多， 一般的诊断实验室不能完成，应由专门从事禽流感检测的参比实验室完成。中和试验(NT)是一种比较敏感而特异的血清学方法，但是其操作繁琐、耗 时费料，临床几乎不用。3. ELISA是近年来发展得较为成熟的一种方法，敏感性较高，缺点是试验的敏感性受 样本质量的影响很大。阴性结果并不表明未感染禽流感病毒，只能解释为未检出。免疫荧 光技术(IF)即荧光抗体(fluoresent antibody, FA)技术，是鉴定和定位流感病毒感染细 胞中特异性的抗原，主要是流感病毒的核蛋白(NP)或基质蛋白(MP抗原)。禽流感病毒 的检测通常采用的是直接荧光法，这种方法用于诊断具有快速、简便和敏感等特点，但是 有时会出现假阳性(非特异性荧光)，间接免疫荧光技术也可以用来检测NP及MP抗原与 抗体的反应，其敏感性很高。但对抗原制备要求较高，需用非离子型去污剂对纯化的病毒 粒子进行裂解。4. RT-PCR方法是一种敏感特异的方法，灵敏度要高于ELISA，由于该技术条件要求高， 且田间样本复杂多变,干扰大,样本处理难，因此大规模检测比较困难。纳米量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductor nanocrystal)，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的稳定的、溶于水的、尺寸在2 20nm之间的纳米晶粒。目前研究较多的是CdS、 CdSe、 CdTe、 ZnS等。近年来，半导体量 子点由于其独特的性质越来越受到人们的重视，其研究内容涉及物理、化学、材料、生物等多学科，已成为一门新兴的交叉学科。量子点由于粒径很小，电子和孔穴被量子限域，连续能带变为具有分子结构的分立能 级结构。因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。与传统的荧光染料相比，量 子点有很多优点无机微晶能够承受多次的激发和光发射，而有机分子却会分解.持久的 稳定性可以让研究人员更长时间地观测细胞和组织，并毫无困难地进行界面修饰连接。量 于点最大的好处是有丰富的颜色。生物体系的复杂性经常需要同时观察几种组分，如果用 染料分子染色，则需要不同波长的光来激发，而量于点则不存在这个问题，使用不同大小 (进而不同色彩)的纳米晶体来标记不同的生物分子。使用单一光源就可以使不同的颗粒 能够被即时监控。并且从紫外线到红光，量子点有广泛的激发光谱范围，能够用量子点的 大小和成分来调节激发光谱。同时量子点具有狭窄对称的荧光发射谱峰，这样就可以同时 使用不同光谱特性的量子点，而发射光谱不出现重叠。因此，纳米量子点作为一种新型的 荧光标记材料，在生物领域中的应用越来越受到了关泛的关注,特别是在临床诊断方法取 得了长足的进展。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检 测方法。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种可用于标记抗体进行生物检测的新型水 溶性羧基化纳米量子点。本专利技术要解决的第三个技术问题是提供超声乳化改性制备量子点的方法。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案H5N1型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，包括如下步骤(1) 制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(2) 制备水溶性羧基化纳米量子点；(3) 纳米量子点标记H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体；(4) 样品测定。所述(1)制备和纯化H5N1型禽流感单克隆抗体的方法为用纯化浓缩的H5N1型禽 流感病毒作为免疫抗原免疫8周龄Balb/c小鼠；获得免疫脾细胞与SP2/0细胞融合得到 杂交瘤细胞；筛选阳性杂交瘤细胞的克隆进行培养获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株；将 杂交瘤细胞株注射入Balb/c小鼠腹腔以体外诱生腹水法获得含单克隆抗体的腹水；采用 辛酸-饱和硫酸胺法浓縮和纯化腹水获得单克隆抗体。所述(1)制备和纯化H5N1型禽流感多克隆抗体的方法为用纯化浓缩的H5N1型禽 流感病毒作为免疫抗原，免疫新西兰大白兔；10天后心脏采血，分离血清；饱和硫酸铵 粗提多抗；DEAE-纤维素层析过柱后纯化的IgG置透析袋中，用固体聚乙二醇包埋进行浓 縮获得多克隆抗体。所述(3)纳米量子点标记H5N1型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体的方法为制备 醛基化玻片；利用交联剂EDC和sulfo-NHS采用共价键连接的方法进行抗体的量子点标记。玻片由于样品不易在其表面渗透和扩散以及它的疏水性，特别是荧光背景低便于荧 光观察等特点，因而被我们作为此课题研究中实验反应的载体。将玻片表面进行醛基化是 在玻片表面固定蛋白最常用的途径。采用氨基硅烷和戊二醛先后进行氨基化和醛基化反 应，在玻片表面形成活化的醛基，活化的醛基与蛋白质的氨基縮合反应，形成共价键的方 法从而在玻片表面固定蛋白质。所述制备醛基化玻片是指将玻片用洗液(K2Cr07 20g +浓H2S04350ml+H20 40ml) 浸泡过夜，然后用大量的去离子水冲洗，6(TC烘干2h后，将玻片浸入5。/。APTES的乙醇溶 液中作用60min进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
Ｈ５Ｎ１型高致病性禽流感的纳米量子点检测方法，其特征在于包括如下步骤： （１）制备和纯化Ｈ５Ｎ１型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体； （２）制备水溶性羧基化纳米量子点； （３）纳米量子点标记Ｈ５Ｎ１型禽流感单克隆抗体或多克隆抗体； （４）样品测定。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马贵平，常津，刘旭辉，张兵波，李冰玲，史喜菊，李炎鑫，刘全国，
申请(专利权)人：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，天津大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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