本发明专利技术涉及一种利用具有Ｄ－乳酸特异性的酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的Ｄ－乳酸诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定Ｄ－乳酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、２高铁细胞色素ｃ、氨离子、Ｄ－乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度／速度，从而测算出Ｄ－乳酸的浓度大小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用具有D-乳酸特异性的D-乳酸诊断/测定试剂盒， 同时本专利技术还涉及测定D-乳酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领 域。
技术介绍
L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有 在食品、饲料、医药、塑料、词料、农药、日用化工、造纸及电子工业等 多领域应用前景。L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、 明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐，以评估微 生物是否产生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，则可能是微 生物造成了污染。乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关 系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在,但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5%。血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段，把血乳酸值作 为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个 重要数据，供安排训练时参考。酶法分析是国际上公认的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳如IFU (国际果汁生产者协会)，AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)， 及MEBAK， OICC， VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用具有D-乳酸特异性的酶循 环f广增 去(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅 酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定D-乳酸浓度的 方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒， 采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行 D-乳酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广 应用。本专利技术D-乳酸浓度测定方法原理如下D-乳酸+2高铁细胞色素(D-乳酸脱氢酶 丙酮酸+2亚铁细胞色素c 丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢这种方法应用具有D-乳酸特异性的D-乳酸脱氢酶(D-Lactate dehydrogenase; EC l丄2.4; EC U.2.5)酶(偶)联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)酶促反应连续监测法。D-乳酸脱氢酶作为作用酶，功能为将D-乳酸酶解产生丙酮酸。丙氨酸脱氢酶的第一个酶促作用使丙酮酸产生丙氨酸；甘氨酸 氧化酶作为循环酶可以一再将丙氨酸再次变回丙酮酸，使丙酮酸不断地被 重复循环利用。丙氨酸脱氢酶又可作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm 处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以 测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度/速度，通过测量340nm处 吸光度下降的速度，可以测算氨基酸(氮)的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术D-乳酸诊断/测定试剂 盒较为理想缓冲液100 mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L2高铁细胞色素c10 mmol/L氨离子20 mmol/LD-乳酸脱氢酶10000U/L丙氨酸脱氢酶10000U/L甘氨酸氧化酶10000U/L本专利技术的D-乳酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素C、氨离子。 试剂2缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢 酶、.甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干 粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶。 还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢 酶、甘氨酸氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直 接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定D-乳酸浓度的方法，其还原 型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一种。具体实施方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。 实施例一本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为单试剂, 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 2高铁细胞色素c包括100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/LD-乳酸脱氢酶10000U/L 10000 U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓度大小。实施例二本实施例的MMM诊断/测定试剂为双试剂，包括:试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂还原型辅酶 -2高铁细胞色素C氨离子100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L试剂2(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂 D-乳酸脱氢f甘氨酸氧化酶100 mmol/L 500 mmol/L10000 U/L10000U/L10000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405證，被测D-乳酸样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓度大小。实施例三本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为三试剂，包括试剂l三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶2高铁细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用具有Ｄ－乳酸特异性的酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的Ｄ－乳酸浓度测定方法，其方法原理如下：Ｄ－乳酸＋２高铁细胞色素ｃ Ｄ－乳酸脱氢酶 丙酮酸＋２亚铁细胞色素ｃ 丙酮酸＋氨离子＋还原型辅酶 丙氨酸脱氢酶 Ｌ－丙氨酸＋水＋辅酶丙氨酸＋水＋氧 甘氨酸氧化酶 氨离子＋丙酮酸＋过氧化氢 将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度／速度，测算出Ｄ－乳酸的浓度大小测定结果。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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