脱氢酶或对应的底物的测定方法及测定用试剂盒技术

测定样品中含的脱氢酶或对应的底物的方法，通过作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP的二者，可进行基于可视部的吸光度的测定，并且，可正确地测定以高浓度存在于样品中的脱氢酶或对应的底物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脱氢酶或对应的底物的测定方法及测定用试剂盒
本专利技术涉及测定样品中的脱氢酶或对应的底物的方法及其中使用的试剂盒。背景技木在血清、血浆等的样品中，存在高浓度的脱氢酶或对应的底物。在临床化学诊断中，为了测定它们，作为辅酶而一般使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤ニ 核苷酸磷酸(NADP)。作为这样的方法中使用的脱氢酶和底物的組合，已知乳酸脱氢酶和乳酸、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸、醇脱氢酶和醇、甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油-3-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸等。此时，为了测定该组合之任何一方，将其他一方与辅酶一同作为试剂使用。另外，与其同样地，为了测定样品中的尿素等的特定物质，通过使特定物质与试剂进行酶反应而作为中间体或最终产物生成特定的脱氢酶或对应的底物，使该脱氢酶或对应的底物与上述辅酶一同反应，结果测定特定物质也广泛进行。在这些的測定方法中，最终一般采用将NAD或NADP通过脱氢酶反应变换为作为还原型的NADH或NADPH，而基于其结果发生的紫外线波长域(通常、340nm)中的吸光度的升高来測定脱氢酶或对应的底物的方法。但是，此时，为了在紫外线区域測定，有作为测定池不使用简便的玻璃或塑料而使用高价的石英的必要，而且有作为分析装置而使用紫外线光源或检测装置的必要，因此，有分析装置易变得大型且高价的倾向。其結果，不可在干燥化学领域或小的医院也可測定的使用可视分光光度计的装置中适用。从而，为了可在那样的场合中使用，期望在可视部測定上述的脱氢酶或对应的底物的方法。另ー方面，在专利文献1中提案，使葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应之吋，作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP和NADH或NADPH的组合，进行酶循环反应，将生成的作为还原型酶的硫代NADH或硫代NADPH基于在400nm附近的可视部的吸光度而测定葡萄糖-6-磷酸的方法。但是，此方法使用酶循环反应，不好说必定是简便的測定方法， 另外不好说是在測定高浓度的测定对象物中适宜的測定方法。现有技术文献专利文献专利文献1 特开平4-335898号公报
技术实现思路
专利技术要解决的技术课题本专利技术的课题在于提供，使基于在可视部的吸光度的測定成为可能，可在干燥化学领域或小的医院也可測定的使用可视分光光度计的装置中适用，并且，正确地测定以高浓度存在于样品中的脱氢酶或对应的底物的方法。解决课题的技术方案本专利技术人着眼于为了如例如专利文献1所述，通过酶循环法测定低浓度的脱氢酶或对应的底物而使用的辅酶硫代NAD或硫代NADP通过酶反应而使可视部的吸光度变化，对于使用该辅酶，测定在样品中以高浓度存在的测定对象的方法进行检查。其結果，将高浓度的测定对象作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP吋，难以在高浓度区域维持直线性，而且空白也有升高的时候，判明不可正确地測定测定对象。本专利技术人尝试了，为了将样品中的某种物质用某酶除去，通过作为辅酶而使用NAD 来进行酶反应，接下来，使用除去该物质的样品而使脱氢酶、对应的底物及硫代NAD反应来測定可视部区域的吸光度，从而测定样品中的脱氢酶或其对应的底物。然而，通过无关于 NAD和硫代NAD的添加的順序，以使样品与脱氢酶、对应的底物、硫代NAD及NAD共存的单纯的构成测定可视部区域的吸光度，令人惊讶地发现，反应空白減少，标准曲线的斜率变小， 可正确地测定样品中的脱氢酶或其对应的底物。其结果判明，通过这样的构成，解决了上述的问题，在高浓度区域也可正确地測定脱氢酶或对应的底物。从而，在以可视部的吸光度测定样品中含的脱氢酶或对应的底物的方法中，通过作为辅酶而，使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP的二者，从而测定对象在高浓度区域也可维持直线性，并且，可使标准曲线的空白变小，其結果，发现可用简便的可视分光光度计在測定对象浓度的宽广的区域提供简单并且正确地測定脱氢酶或对应的底物的方法， 从而完成本专利技术。从而，本专利技术涉及使用脱氢酶、对应的底物及辅酶进行反应而测定样品中的该脱氢酶或对应的底物的測定方法，所述方法包括作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP及 NAD或NADP进行反应，以及测定源于生成的硫代NADH或硫代NADPH的吸光度的増加。再者，本专利技术涉及测定样品中的特定物质的測定方法，所述方法包括通过使样品中的特定物质经历酶反应来作为中间体或最终产物生成脱氢酶或对应的底物，使该脱氢酶或对应的底物经历上述的測定方法，以及基于作为中间体或最终产物生成的脱氢酶或对应的底物的量来测定样品中的特定物质。再者，本专利技术涉及用于测定脱氢酶或对应的底物的測定用试剂盒，所述试剂盒包含选自脱氢酶和对应的底物的测定对象以外的成分作为必须成分，并且，包含作为辅酶的硫代NAD或硫代NADP和NAD或NADP作为必须成分。再者，本专利技术涉及用于测定特定物质的測定用试剂盒，所述试剂盒包含用于从特定物质通过酶反应衍生脱氢酶或对应的底物的成分、以及衍生该脱氢酶和对应的底物的成分以外的成分作为必须成分，并且，包含作为辅酶的硫代NAD或硫代NADP和NAD或NADP作为必须成分。专利技术效果根据本专利技术，即便以可视部的吸光度测定样品中含的脱氢酶或对应的底物，通过作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP的二者，测定对象在高浓度区域也可维持直线性，并且，可使标准曲线的空白变小。其結果，可用简便的可视分光光度计在测定对象浓度的宽广的区域，简单并且正确地測定。附图说明图1是示在实施例1、2及3以及比较例1的方法中測定尿素氮的结果的图。实施方式作为本专利技术中使用的样品而言，优选为血清、血浆、尿等的活体样品、或者它们的模型样品。本专利技术的测定对象是样品中的脱氢酶或对应的底物，另外，是可通过酶反应作为中间体或最终产物生成脱氢酶或对应的底物的样品中的特定物质。在本专利技术中，在进行脱氢酶反应之吋，作为辅酶而使硫代NAD或硫代NADP及NAD 或NADP的二者存在而进行反应。硫代NAD或硫代NADP和NAD或NADP的组合可为任何，但优选为硫代NAD和NAD的组合，或者硫代NADP和NADP的组合。以下，有时候将硫代NAD或硫代NADP简写为硫代NAD (P)。另外，有时候将NAD或 NADP 简写为 NAD (P)。在本专利技术中，硫代NAD是指硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，硫代NADP是指硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。另外，NAD是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADP是指烟酰胺腺嘌呤ニ 核苷酸磷酸。在本说明书中，硫代NADH、硫代NADPH、NADH、NADPH是指，辅酶的还原型，即，各自是指硫代NAD、硫代NADP、NAD、NADP的还原型。以下，有时将硫代NADH或硫代NADPH简写为硫代NAD (P)H。另外，有时将NADH或NADPH简写为NAD (P)H。在本专利技术中，使用的NAD(P)的量不特别限定，但优选为使用的硫代NAD⑵的量的 0. 5倍摩尔数以上，更优选为1. 5 30倍摩尔数，最优选为3. 0 20倍摩尔数。NAD (P)的量过少，则难维持标准曲线的直线性，另外，也有空白降低不充分之时。另一方面，NAD(P)的量过大，则标准曲线的直线的斜率变小，难正确地測定测定对象。在本专利技术中，作为辅酶而使用硫代NAD(P)及NAD(P)的二者而进行脱氢酶反应，测定源于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：野田健太，佐藤善郎，小岛良，
申请(专利权)人：日东纺绩株式会社，
类型：发明
国别省市：