一种高纯度重组白介素-2的制备工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种高纯度重组白介素‑2的制备工艺，属于生物医药技术领域。本发明专利技术高纯度重组白介素‑2的制备工艺包括如下步骤：以大肠杆菌基因重组形成白介素‑2发酵液，从白介素‑2发酵液提取包涵体，将包涵体裂解，并进行复性处理，得到白介素‑2复性液；将白介素‑2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为精纯产物；将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组白介素‑2；本发明专利技术的方法制得高纯度重组白介素‑2回收率高、活性高、纯度高。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度重组白介素-2的制备工艺
本专利技术属于生物医药
，涉及一种高纯度重组白介素-2的制备工艺。
技术介绍
IL-2主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞(特别是CD4+T细胞)产生，为一种糖蛋白，具有广泛生物活性，能使T细胞在试管内长期存活。随着研究的不断深入，尤其是1983年基因工程(重组)IL-2的问世，使得IL-2的研究取得了更大的进展。人们发现IL-2除了作用于T细胞外，还可作用于多种免疫效应细胞，包括B细胞，巨噬细胞，NK细胞。IL-2可刺激能产生抗体的B细胞增殖并能诱导产生新型的杀伤细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，故IL-2成为调控免疫应答的重要因子，具有抗病毒，抗肿瘤及改善和提高机体免疫功能的作用。可提高人体对病毒，细菌，原虫等感染的免疫应答，清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可以增进抗体和白介素-2的分泌，可刺激产生IFN-γ和TNF-α，β；促进Th的增殖和激活；活化中性粒细胞；刺激NK和肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)增殖。目前，IL-2已被应用于治疗肿瘤，免疫缺陷和感染性疾病，并取得了显著的效果。目前市售的lL-2主要以重组人白介素-2为主，以基因工程菌为基础，利用生物发酵法配合大规模的分离纯化技术，最终得到高纯度的重组人白介素-2蛋白质。由于重组蛋白质主要是经过发酵表达所得，发酵液中的成分往往很复杂，有活细胞、死细胞、细胞外产物、细胞内释放物、残余的底物等物质，因此要从如此复杂的环境中得到目的蛋白质，同时又要保持蛋白质的生物学活性，其分离纯化工作相对比较复杂。现有的分离纯化需要将包涵体溶解、复性，然后进行多步膜分离、层析，往往具有步骤繁杂、回收率相对较低等缺点。基因工程菌所表达的重组白介素-2通常以包涵体的形式存在，需要将其变性裂解、纯化再复性，在复性过程中二硫键易发生错配，导致白介素-2活性下降。变性裂解过程中往往需要使用变性剂，在后续工艺中如不去除，在产品进一步进行浓缩时，必然会影响产品活性。且由于IL-2易被内毒素污染，限制了其治疗应用。内毒素又名脂多糖、类脂A、热源，是革兰氏阴性细菌(GNB)的细胞壁外壁层上的特有结构，其细胞壁外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成，当细菌死亡时溶解或用人工方法破坏菌细胞后会释放大量内毒素，一个大肠杆菌细胞内约含有200万个LPS分子。内毒素的热稳定性极高，在250℃干热下长达1h才会被分解。内毒素对pH值变化也不敏感，但高浓度的酸或碱可使之失活。内毒素分子由于具有磷酸基团而带负电荷，因此理论上可以用带正电荷的吸附剂来去除，如采用阴离子交换色谱来去除内毒素。然而，实际上这种结合效果不佳。其原因一方面是天然存在的内毒素分子上所携带的磷酸基团(负电荷)已经被阳电荷的离子(Ca2+，Mg2+，Na+，K+等)或多胺(尸胺、精胺、亚精胺、乙醇胺)等中和；另一方面，在自然界中内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，内毒素分子与本身所携带的负电荷参与了聚合体的形成，很少有游离的负电荷暴露在集聚体外表；再者，溶液中往往还存在有其他带负电荷的物质，导致内毒素难以完全分离，如二乙基胺乙基(DEAE)阴离子交换介质仅适于从碱性蛋白质中去除内毒素。因此，在溶液中去除内毒素污染或消除内毒素便成了生物研究中的一个难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种回收率高、活性高、纯度高的高纯度重组白介素-2的制备工艺。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种高纯度重组白介素-2的制备工艺，所述高纯度重组白介素-2的制备工艺包括如下步骤：S1、制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，将包涵体裂解，并进行复性处理，得到白介素-2复性液；S2、粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；S3、精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为精纯产物；S4、终纯处理：将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组白介素-2。本专利技术通过三步分离纯化处理，有效去除了重组白介素-2发酵液中的核酸、杂蛋白、内毒素等杂质，去除效率高，最终可获得高纯度的白介素-2产品。其中粗纯处理采用疏水高效液相色谱柱进行，可有效去除发酵液中的核酸等物质，精纯处理采用反相高效液相色谱柱进行，可有效去除其中的杂蛋白、IL-2聚合体及同分异构体等与IL-2极性有较小差异的杂质，终纯处理采用弱阴离子高效液色谱柱中进行，可有效去除内毒素，提高产品的使用安全性。作为优选，步骤S1所述提取包涵体的方法为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS缓冲液进行洗涤；所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)、8～13mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40～60mmol/LPB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0～8.0；所述复性处理的方法为：先采用0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过4mg/ml，然后加入复性剂搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.1～0.2mg/ml，且SDS浓度至0.05～0.06wt％。作为优选，所述包涵体裂解的时间为5～7h。作为优选，所述复性剂为40～60mmol/L的PB缓冲液，PH为7.0～8.0。采用大肠杆菌基因工程菌生产IL-2时，由于IL-2存在于大肠杆菌工程菌的细胞内层膜，且其疏水性很强，IL-2基因在工程菌大肠杆菌中表达时，因大肠杆菌为原核表达系统，没有翻译后加工和修饰，IL-2在细胞内积累而形成不溶性的蛋白质聚合物，即包涵体，因此IL-2通常以包含体的形式存在于大肠杆菌工程菌细胞内。包涵体的外形为球形，为0.5～1μm的折光小体，包涵体中大部分(占50％以上)是克隆表达的产物，这些产物的一级结构是正确的，但没有经过正确折叠形成天然的高级结构，因此没有生物学活性。包涵体经过溶解复性才能得到具有生物学活性的蛋白。包涵体的相对硬度比较大，一般条件下不溶于水，在有如盐酸胍、尿素等较强的变性剂存在的条件下能够发生溶解，此时的蛋白质自身的高级结构被打开，以变性状态存在，这给IL-2的分离纯化带来了较大的困难。因此在进行分离纯化时，首先要破碎菌体，提取包涵体，然后进行复性和分离纯化。本专利技术的裂解剂中SDS能够有效打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构，使多肽伸展，DTT作为还原剂可以打开包涵体蛋白质中所有二硫键，从而使包涵体充分裂解，形成多肽链。SDS既是包涵体的裂解剂(即蛋白质的变性剂)也是IL-2的助溶剂，IL-2分子与SDS充分结合形成带负电荷的IL-2-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了IL-2分子原有的电荷量，消除了不同IL-2分子之间原有的电荷本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，所述高纯度重组白介素-2的制备工艺包括如下步骤：/nS1、制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，将包涵体裂解，并进行复性处理，得到白介素-2复性液；/nS2、粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；/nS3、精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为精纯产物；/nS4、终纯处理：将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组白介素-2。/n

【技术特征摘要】
1.一种高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，所述高纯度重组白介素-2的制备工艺包括如下步骤：
S1、制备白介素-2复性液：以大肠杆菌基因重组形成白介素-2发酵液，从白介素-2发酵液提取包涵体，将包涵体裂解，并进行复性处理，得到白介素-2复性液；
S2、粗纯处理：将白介素-2复性液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
S3、精纯处理：将粗纯产物加入到反相高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为精纯产物；
S4、终纯处理：将精纯产物加入到弱阴离子高效液色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组白介素-2。


2.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S1所述提取包涵体的方法为对重组白介素-2发酵液进行超声破菌处理，然后离心、用40～60mmol/L、PH8.5～9.0的PBS缓冲液进行洗涤；
所述包涵体裂解在裂解剂中进行，所述裂解剂包括以下组分：0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)、8～13mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、40～60mmol/LPB缓冲液，所述PB缓冲液的PH为7.0～8.0；
所述复性处理的方法为：先采用0.8～1.2wt％十二烷基硫酸钠(SDS)将包涵体裂解液稀释至蛋白浓度不超过4mg/ml，然后加入复性剂搅拌稀释至包涵体裂解液中的蛋白浓度为0.1～0.2mg/ml，且十二烷基硫酸钠(SDS)浓度至0.05～0.06wt％。


3.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2的制备工艺，其特征在于，步骤S2所述疏水高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合疏水性基团，所述疏水性基团为苯基基团。


4.根据权利要求1所述的高纯度重组白介素-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛民，陈平，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33