一种高纯度重组胰蛋白酶的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种高纯度重组胰蛋白酶的制备方法。本发明专利技术先对表达重组胰蛋白酶原的发酵液进行活化，然后依次采用疏水作用层析和阳离子交换层析，依次组合的纯化方式极为有效的去除重组胰蛋白酶的相关杂蛋白及减少a

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度重组胰蛋白酶的制备方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种高纯度重组胰蛋白酶的制备方法。

技术介绍

[0002]胰蛋白酶(Trypsin，EC3.4.21.4)是生物制品生产过程中一种重要的生物原材料，属于丝氨酸蛋白酶。其在胰脏中以作为酶的前体胰蛋白酶原的形式被合成，并作为胰液的成分而分泌，在钙离子的存在下，被肠激酶酶解或被胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶是肽链内切酶，它不仅起到消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶。胰蛋白酶可特异性地切割碱性氨基酸，如赖氨酸和精氨酸的羧基端肽键。胰蛋白酶的主要商业用途是作为工业用酶用于重组人胰岛素的工业生产、激活病毒颗粒、疫苗生产过程中细胞处理等。最初，胰蛋白酶的生产是由猪、牛、羊等动物的胰脏中直接提取，由于动物来源的酶的使用存在潜在的病毒污染，在生物制药过程中已经换用重组胰蛋白酶。因此在工业应用上特别是对于药物的生产过程中需要使用提供来自微生物宿主的重组胰蛋白酶。但是由于胰蛋白酶是活性强的肽链内切酶，可水解任何暴露在蛋白表面的赖氨酸和精氨酸残基的羧基端形成的肽键，包括其自身，所以一般的胰蛋白酶在pH3以上不稳定，会自身水解，而且微量活性胰蛋白酶的存在就可以对表达的宿主细胞产生毒素，一种解决的方法是以胰蛋白酶原的形式表达，发酵结束后或在纯化过程中通过自身催化活化方法生成胰蛋白酶。
[0003]目前已经有一些研究对发酵液中的重组胰蛋白酶原进行提取、活化和纯化，如中国专利申请CN201910720623.9公开了一种重组胰蛋白酶的生产工艺，通过阳离子交换树脂对发酵液进行纯化得到胰蛋白酶原，然后调节pH值对酶原进行活化。但是毕赤酵母发酵液上清电导率较高，一般为15ms/cm～30ms/cm，该阳离子交换层析进样时用纯净水稀释料液电导率至约7ms/cm以下才能进行捕获。因此毕赤酵母发酵液需要进行稀释后才能使用阳离子交换树脂捕获酶原，而纯化前的稀释过程在进行大规模生产时会造成极大的水资源浪费，而且稀释后体积增大，导致纯化时间的延长。而且，2020年《中国药典》增加了重组胰蛋白酶的质量标准，RP
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HPLC分析检测要求：β
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胰蛋白酶不低于70％，a
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胰蛋白酶不高于20％，比活性不低于3800U/mg。为了符合《中国药典》重组胰蛋白酶的质量标准，建立一种工业化大规模制备高纯度重组胰蛋白酶的方法至关重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种高纯度重组胰蛋白酶的制备方法及由该制备方法制备得到的高纯度重组胰蛋白酶。
[0005]本专利技术的一个目的在于提供一种高纯度重组胰蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：
[0006]将含有重组胰蛋白酶原的发酵液分离得到上清液，活化，得到含有重组胰蛋白酶
的溶液；
[0007]含有重组胰蛋白酶的溶液经过疏水作用层析分离和阳离子交换层析分离，得到高纯度重组胰蛋白酶。
[0008]作为优选，所述活化步骤包括：在上清液中加入氯化钙，然后调节pH至7.5～9.0，室温下活化10～40h。优选地，加入氯化钙使得上清液中氯化钙的浓度为10～100mmol/L。优选地，室温下活化的搅拌速度为100～400rpm/min。
[0009]作为优选，活化后，调节pH至2.0～4.0，终止活化。
[0010]作为优选，疏水作用层析分离采用的色谱柱填料为硅胶基质表面键合苯基基团的疏水性填料，孔径为200～400埃，粒径为3～12μm。优选为由宁波博睿瀚达生物科技有限公司生产制备的孔径为200～400埃，粒径为5μm或10μm的硅胶基质表面键合苯基基团的疏水性填料。
[0011]作为优选，疏水作用层析分离的步骤包括：含有重组胰蛋白酶的溶液在室温下放置2小时以上，然后进样，进样结束后，分别用洗脱液A和洗脱液B进行洗脱，洗脱液不收集，然后使用洗脱液B和洗脱液C进行线性梯度洗脱，洗脱100～200min，收集目的蛋白峰。
[0012]上述疏水作用层析分离过程中，作为优选，含有重组胰蛋白酶的溶液在室温下放置2小时以上后，用管式膜超滤，管式膜的截留分子量为6
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10KD。
[0013]上述疏水作用层析分离过程中，作为优选，洗脱液A为0.015～0.05v/v％三氟乙酸水溶液，洗脱液B为含0.03％～0.08v/v％三氟乙酸的2～8v/v％乙醇水溶液，洗脱液C为含0.05％～0.2v/v％三氟乙酸的30～50v/v％乙醇水溶液。
[0014]上述疏水作用层析分离过程中，作为优选，采用洗脱液A洗2～4倍柱体积，采用洗脱液B洗1～3倍柱体积。
[0015]上述疏水作用层析分离过程中，作为优选，线性梯度洗脱过程中，梯度开始(0分钟)时，流动相为100％洗脱液B，洗脱结束时，流动相为100％洗脱液C。
[0016]上述疏水作用层析分离过程中，作为优选，进样量是色谱柱饱和吸附量的5～15％，进样的流速为80～150mL/min，线性梯度洗脱流速为30～70mL/min。
[0017]上述疏水作用层析分离过程中，作为优选，目的蛋白峰的UV基线开始上升，上升后前2～4min的洗脱液不收集，收集2～4min后的洗脱液。疏水作用层析分离过程中，线性梯度洗脱收集目的蛋白时通过时间切割分段收集(即UV基线上升2～4min后，开始收集目的蛋白峰)可以有效降低活性低的a
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胰蛋白酶的含量。
[0018]疏水作用层析分离后，对色谱柱填料进行再生处理，再生处理包括以下步骤：分别用再生液以及洗脱液A进行洗脱。再生液优选为含0.08～0.12v/v％三氟乙酸的50～70v/v％的乙醇水溶液，分别采用再生液和洗脱液A洗2～4倍柱体积。
[0019]含有重组胰蛋白酶的溶液经过疏水作用层析分离，可以有效分离去除活性低的a
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胰蛋白酶，以及除去色素、多聚体、宿主杂蛋白等。
[0020]作为优选，阳离子交换层析分离采用的色谱柱填料的阳离子交换基团是羧甲基CM，基质为硅胶基质，孔径为200～400埃，粒径为3～12μm(优选为由宁波博睿瀚达生物科技有限公司生产制备的孔径为200～400埃，粒径为5μm或10μm的硅胶基质表面键合羧甲基CM的阳离子交换填料)。
[0021]作为优选，阳离子交换层析分离的步骤包括：将疏水作用层析分离得到的重组胰
蛋白酶溶液预处理，进样，进样结束后，分别用洗脱液D和洗脱液E进行洗脱，洗脱液不收集，然后使用洗脱液F进行洗脱，收集目标蛋白峰。
[0022]上述阳离子交换层析分离过程中，作为优选，预处理包括：在疏水作用层析分离得到的重组胰蛋白酶溶液中加入氯化钙至氯化钙浓度为1～10mmol/L，然后调节pH为4.0～5.0，之后加入pH4.0～5.0、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高纯度重组胰蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有重组胰蛋白酶原的发酵液分离得到上清液，活化，得到含有重组胰蛋白酶的溶液；含有重组胰蛋白酶的溶液经过疏水作用层析分离和阳离子交换层析分离，得到高纯度重组胰蛋白酶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化步骤包括：在上清液中加入氯化钙，然后调节pH至7.5～9.0，室温下活化10～40h。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，疏水作用层析分离采用的色谱柱填料为硅胶基质表面键合苯基基团的疏水性填料，孔径为200～400埃，粒径为3～12μm；疏水作用层析分离的步骤包括：含有重组胰蛋白酶的溶液在室温下放置2小时以上，然后进样，进样结束后，分别用洗脱液A和洗脱液B进行洗脱，洗脱液不收集，然后使用洗脱液B和洗脱液C进行线性梯度洗脱，洗脱100～200min，收集目的蛋白峰。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，洗脱液A为0.015～0.05v/v％三氟乙酸水溶液，洗脱液B为含0.03％～0.08v/v％三氟乙酸的2～8v/v％乙醇水溶液，洗脱液C为含0.05％～0.2v/v％三氟乙酸的30～50v/v％乙醇水溶液；和或，线性梯度洗脱过程中，开始梯度(0分钟)时，流动相为100％洗脱液B，洗脱结束时，流动相为100％洗脱液C；和或，进样量是色谱柱饱和吸附量的5～15％，进样的流速为80～150mL/min，线性梯度洗脱流速为30～70mL/min。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，目的蛋白峰的UV基线上升2～4min后，收集洗脱液。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，阳离子交换层析分离采用的色谱柱填料的阳离子交换基团是羧甲基，基质为硅胶基质，孔...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛民，李浛君，陈平，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：