一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法，包括以下步骤：大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b发酵液经过菌体收集、匀浆破菌获得包涵体，包涵体经洗涤、变性溶解及稀释复性，再进行浓缩，所述浓缩包括：吸附剂前处理；复性液前处理；往前处理后的吸附剂中加入pH为2～3的水匀浆，然后加入前处理后的复性剂，搅拌吸附5～50min，置于0～6℃下放置1～5h，收集沉淀，沉淀倒入布氏漏斗中，抽真空，采用洗脱液1洗脱，流出液不收集，然后用洗脱液2淋洗，收集流出液。本发明专利技术的浓缩方法可以快速达到浓缩目的，提高蛋白收率，还能有效去除复性沉淀、悬浮物、大分子粘稠的核糖核酸、疏水弱的杂蛋白等。疏水弱的杂蛋白等。

【技术实现步骤摘要】
一种分离浓缩重组人干扰素
α
2b复性液的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法。

技术介绍

[0002]干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒的蛋白质，根据干扰素氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为三类：α干扰素、β干扰素以及r干扰素，其中α干扰素是应用最为广泛的一类干扰素。重组人干扰素α2b具有广普抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增值以及提高免疫功能等作用，可以用来治疗病毒性乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性脑膜炎、病毒性眼感染、肾癌、毛细白血病、恶性皮肤淋巴瘤、成骨肉瘤、多发性硬症等。
[0003]目前工业化生产的重组人干扰素α2b多以不溶性包涵体形式表达，不溶性包涵体的形成主要有两个原因：(1)重组人干扰素α2b大肠杆菌中高效表达，产量很高，容易相互聚集形成包涵体；(2)含二硫键的重组人干扰素α2b在大肠杆菌胞浆中表达，因处在还原状态的细胞环境中，重组人干扰素α2b会形成错误的二硫键导致形成沉淀。包涵体是原核细胞表达的产物，是没有生物活性的蛋白质聚集体，所以在工业化生产重组人干扰素α2b的过程中，需要破碎细胞提取包涵体、并对包涵体进行变性溶解、复性(重新折叠恢复活性)以恢复干扰素自然空间折叠状态，成为具有生物活性的粗制干扰素。
[0004]包涵体被变性溶解后，再进行进一步的体外折叠，使蛋白质恢复天然构象，即蛋白复性。在工业化生产中，主要有两种重新折叠恢复蛋白活性方式：稀释法和透析法。采用稀释法的回收率明显高于透析法复性，若采用透析法要达到相同的复性效果，则无法实现工业化生产。但稀释复性法对样品体积约百倍的稀释，会使样品的体积急剧增大，使色谱柱分离进样时间冗长，还需膜超滤去除影响柱分离的成份如变性剂、使柱压能大幅升高的粘稠大分子核酸和微浑浊物质等，增加了分离时间又降低了分离效果。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法。
[0006]本专利技术的一个目的通过以下技术方案来实现：一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法，包括以下步骤：
[0007]S1、获得包涵体：将大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b发酵液离心和/或过滤方式获得菌体，加入pH为8.0～9.0的含50～200mM氯化钠的Tris
‑
EDTA缓冲液和溶菌酶，搅拌至粘稠状后置于0～6℃下6～20小时；然后匀浆破菌，收集沉淀即为粗包涵体；
[0008]S2、洗涤包涵体：往步骤S1获得的粗包涵体中加入洗涤液1，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀1；在沉淀1中加入洗涤液2，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀2；在沉淀2中加入洗涤液3，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀3；
[0009]S3、包涵体变性溶解：往步骤S2收集的沉淀3中加入变性液，置于0～6℃下磁力搅
拌4～10小时，离心去沉淀收集变性溶解液；
[0010]S4、稀释复性：将复性稀释液1缓慢加入磁力搅拌的步骤S3获得的变性溶解液中得到复性稀释第一步液；将复性稀释第一步液缓慢加入到磁力搅拌的复性稀释液2中，搅拌均匀，置于0～6℃下放置1～5天，得复性液；
[0011]S5、复性液浓缩：吸附剂前处理；复性液前处理；往前处理后的吸附剂中加入2～3倍吸附剂体积的pH为2～3的水，摇匀后水浴超声10～30min，加入前处理后的复性液中，搅拌吸附10～30min，置于0～6℃下放置1～5h，收集沉淀，沉淀倒入布氏漏斗中，抽真空，采用洗脱液1洗脱，流出液不收集，然后用洗脱液2淋洗，收集流出液。
[0012]作为优选，步骤S1中，缓冲液加入体积(ml)与湿菌体质量(g)的比例为15:1～5:1，溶菌酶加入量按每克湿菌体添加1～10mg。
[0013]作为优选，匀浆破菌在加压到500～600bar的高压均质机中进行，匀浆2～3次，镜检视野里无完整的大肠杆菌。
[0014]作为优选，洗涤液1是pH为8.0～9.0的含0.5～1.0wt％曲拉通X
‑
100、2～3wt％蔗糖和0.15～0.3wt％脱氧胆酸钠的Tris
‑
EDTA缓冲液；洗涤液2是pH为8.0～9.0的含2～3mol/L尿素的磷酸盐缓冲液；洗涤液3是pH为8.0～9.0的磷酸盐缓冲液。
[0015]上述Tris
‑
EDTA缓冲液中，Tris浓度可列举为50～100mM，EDTA浓度可列举为1～3mM；洗涤液2和洗涤液3的磷酸盐缓冲液中，磷酸盐浓度可列举为30～100mmol/L。
[0016]菌体破碎后离心获得的包涵体沉淀中除了包含重组蛋白(重组人干扰素α2b)外还有宿主蛋白，如RNA聚合酶、外膜蛋白、酶等，包涵体上还会附着有16SrRNA、23SrRNA和DNA质粒等杂质，这些杂质都是在表达过程中和包涵体的疏水区相结合的，会影响后续的蛋白复性效果。因此，为了除去这些杂质，需要对包涵体进行多遍洗涤，本专利技术采用洗涤液1、洗涤液2、洗涤液3分别对沉淀进行清洗，可以有效去除杂质，包涵体SDS
‑
PAGE还原电泳纯度不低于90％，提高蛋白复性效果及减轻色谱柱精纯负担。
[0017]作为优选，步骤S3中，变性液是pH为10～11的含7～8mol/L盐酸胍和10～20mmol/L二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液中的磷酸盐浓度可列举为30～100mmol/L。
[0018]作为优选，复性稀释液1是pH为8.5～9.0的含2～3mol/L盐酸胍的磷酸盐缓冲液；复性稀释液2是pH为8.5～9.0的磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液中的磷酸盐浓度可列举为20～50mmol/L。
[0019]作为优选，复性稀释液1的加入量使得复性稀释第一步液中盐酸胍的浓度3～4mol/L、重组人干扰素α2b的浓度为1～4mg/ml；复性稀释液2的加入量使得复性液中盐酸胍的浓度为0.3～0.4mol/L、重组人干扰素α2b的浓度为0.1～0.4mg/ml。经过研究发现，当重组人干扰素α2b蛋白浓度为0.1～0.4mg/ml时，能够更好地恢复重组人干扰素α2b的活性；且复性液中盐酸胍的浓度为0.3～0.4mol/L时，对复性具有有效的促进作用。
[0020]作为优选，吸附剂为硅胶基质表面键合苯基基团的疏水性填料，孔径为200～400埃，粒径为10～30μm。优选为由宁波博睿瀚达生物科技有限公司生产制备的孔径为200～400埃，粒径为20μm的硅胶基质表面键合苯基基团的疏水性填料；该类型吸附剂对重组人干扰素α2b具有优异的吸附作用。
[0021]作为优选，所述吸附剂前处理包括以下步骤：在吸附剂中加入2～3倍吸附剂体积的80～95％乙醇，摇匀后水浴超声10～30min，匀浆后，倒入布氏漏斗中，抽真空，然后依次
采用水、pH为2～3的70～90％乙腈水溶液、pH为2～3的水淋洗，淋洗至流出液pH为2～3，真空抽至水份不流出。pH为2～3的乙腈或水是采用盐酸调节至该pH。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获得包涵体：将大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b发酵液离心和/或过滤方式获得菌体，加入pH为8.0～9.0的含50～200mM氯化钠的Tris
‑
EDTA缓冲液和溶菌酶，搅拌至粘稠状后置于0～6℃下6～20小时；然后匀浆破菌，收集沉淀即为粗包涵体；S2、洗涤包涵体：往步骤S1获得的粗包涵体中加入洗涤液1，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀1；在沉淀1中加入洗涤液2，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀2；在沉淀2中加入洗涤液3，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀3；S3、包涵体变性溶解：往步骤S2收集的沉淀3中加入变性液，置于0～6℃下磁力搅拌4～10小时，离心去沉淀收集变性溶解液；S4、稀释复性：将复性稀释液1加入步骤S3获得的变性溶解液中得到复性稀释第一步液；将复性稀释第一步液加入复性稀释液2中，搅拌均匀，置于0～6℃下放置1～5天，得复性液；S5、复性液浓缩：吸附剂前处理；复性液前处理；往前处理后的吸附剂中加入2～3倍吸附剂体积的pH为2～3的水，摇匀后水浴超声10～30min，然后加入前处理后的复性剂，搅拌吸附10～30min，置于0～6℃下放置1～5h，收集沉淀，沉淀倒入布氏漏斗中，抽真空，采用洗脱液1洗脱，流出液不收集，然后用洗脱液2淋洗，收集流出液。2.根据权利要求1所述的分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法，其特征在于，步骤S1的匀浆破菌在加压到500～600bar的高压均质机中进行，匀浆2～3次。3.根据权利要求1所述的分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法，其特征在于，洗涤液1是pH为8.0～9.0的含0.5～1.0wt％曲拉通X
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100、2～3wt％蔗糖和0.15～0.3wt％脱氧胆酸钠的Tris
‑
EDTA缓冲液；洗涤液2是pH为8.0～9.0的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛民，李浛君，陈平，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：