一种无内毒素的水蛭素抗凝血真空采血管及其制备方法技术

本发明专利技术涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管及其制备方法，在真空采血管的内壁上涂有重组水蛭素，每100μg重组水蛭素中内毒素含量＜0.25EU/ml，其中，重组水蛭素为采用阴离子交换色谱法对重组水蛭素蛋白液进行分离得到，包括如下步骤：进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。本发明专利技术真空采血管内壁喷涂去除内毒素的水蛭素，可提高血液检测的准确性，特别适用于血液样品中含致热源的特殊项目检测要求，安全可靠。全可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种无内毒素的水蛭素抗凝血真空采血管及其制备方法


[0001]本专利技术涉及医疗器械
，具体涉及一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管及其制备方法。

技术介绍

[0002]真空采血管是临床上普遍使用的用于血液检测采集的医疗器械产品，利用复压自动定量采集静脉血样，根据检测目的不同可分为普通采血管、含促凝剂采血管、含抗凝剂采血管等。其中，用于快速血浆生化血流变试验的采血管内通常添加有肝素、枸橼酸钠、EDTA等抗凝剂，然而传统的抗凝采血管的抗凝血时间有限，对血液有较大干扰，容易引起溶血反应，且化学抗凝剂含较多杂质、重金属。水蛭素也是常见的抗凝剂，如公开号为CN101779959A的中国专利就提供了一种水蛭素真空采血管，可适合多项检查使用。
[0003]自然界中，天然水蛭素在水蛭中的含量有限，从水蛭中难以提取大量水蛭素，不能满足临床的使用要求，因而通过基因工程重组水蛭素成为国内外医药界的研究重点。重组水蛭素在第63位氨基酸Tyr残基上脱SO3‑
，其余结构与性质跟天然水蛭素基本相同。最早的重组水蛭素cDNA已于20世纪80年被成功克隆出来，至今重组水蛭素已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌及真核细胞等成功表达。
[0004]然而，目前的研究重点主要在重组水蛭素的制备和表达方面，而对进一步的分离和纯化研究则相对较少。借助于细菌或真菌等微生物表达发酵制得的重组水蛭素中，不仅存在宿主蛋白、色素、培养基等杂质组分，还有菌体裂解产生的内毒素，这类物质积累作用于人体会产生一系列毒性反应，如发热、炎症甚至休克等问题，而用于制备抗凝真空采血管还会污染血液样品，影响检测结果和效率，尤其是当血液中含有致热源时，无法满足检测准确性要求。因此，通过发酵培养制备的重组水蛭素必须通过合理的纯化工艺去除蛋白溶液的内毒素，才可用于抗凝血真空采血管的制备，而目前针对去除重组水蛭素中内毒素的研究仍然较少。

技术实现思路

[0005]针对上述技术问题，本专利技术提供一种制备方法简单、适用于大规模工业化生产的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管。
[0006]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实施：
[0007]一种无内毒素的水蛭素抗凝血真空采血管，在真空采血管的内壁上涂有重组水蛭素，100μg重组水蛭素中内毒素含量＜0.25EU/ml。
[0008]重组水蛭素可与血液中凝血酶专一、特异性结合，具有显著的抗凝血作用，作为采血管内壁抗凝剂涂层对检测结果干扰极小。并且，本专利技术的真空采血管所用的水蛭素抗凝剂中几乎不含内毒素，纯度较高，抗凝血成分单一，无菌、无毒，安全性好，适用于血液中致热源等特殊项目的检测，提高血液检测的准确性。
[0009]作为优选，本专利技术的重组水蛭素为采用高效液相阴离子交换色谱法对重组水蛭素
蛋白液进行分离得到。
[0010]阴离子交换色谱以离子交换剂作为分离固定相，同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合，如蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间，带相同电荷类型的离子会竞争性地结合与其电荷相反的固定相介质。本专利技术中，重组水蛭素与离子交换剂表面的吸附作用力较弱，洗脱时优先流出色谱柱，而与固定相吸附作用力强的内毒素成分需通过洗脱能力更强的再生液冲洗下来，该方法简单快捷，可有效除去重组水蛭素蛋白溶液中的内毒素杂质。
[0011]本专利技术的另一目的在于提供一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管的制备方法，包括如下步骤：
[0012]S1、用超声波对采血管进行清洗、干燥；
[0013]S2、在采血管内壁表面涂覆硅化剂，高温固化硅化剂；
[0014]S3、用环氧乙烷对采血管进行灭菌，并去除残留环氧乙烷；
[0015]S4、采用高效液相阴离子交换色谱法去除重组水蛭素中的内毒素，并用无热源的注射用水稀释后除菌过滤，得到无菌、无内毒素的水蛭素抗凝剂；
[0016]S5、在无菌环境下，在采血管内壁自上而下2cm处喷雾涂水蛭素抗凝剂，干燥后，对采血管抽真空并密封。
[0017]作为优选，步骤S2中的硅化剂为二甲基二氯硅烷或二甲基二硅胺。
[0018]作为优选，步骤S2中固化硅化剂的温度为130～180℃。
[0019]作为优选，步骤S4中高效液相阴离子交换色谱法具体包括如下步骤：
[0020]进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；
[0021]洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；
[0022]柱再生：用再生液进行等度洗脱内毒素，弃去流出部分。
[0023]阴离子交换色谱分离时的进样量对分离效果也有显著影响。由于色谱柱的最大载样量受到填料颗粒大小、填料表面键合密度、色谱柱尺寸等因素影响，进样量往往需要根据不同色谱柱的饱和吸附量来确定。但专利技术人在实践中发现，即使按照最大载样量进样，重组水蛭素蛋白的纯化回收和除杂的总效率并不高。而本专利技术的进样量远远小于色谱柱的最大载样量，这是由于进样量继续增大，虽然不会引起重组水蛭素蛋白回收率的下降，但内毒素的去除效果下降的非常大。而若进样量小于最大载样量的25％，则重组水蛭素蛋白的回收率会明显降低，但内毒素的去除效果却明显提升。因此本专利技术通过进样量的合理调控来实现重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的去除效果和最佳的水蛭素回收率。
[0024]进一步优选，本专利技术中阴离子交换色谱的进样量为色谱柱最大载样量的30％。
[0025]作为优选，本专利技术的平衡液为浓度为8～20mmol/L、pH值为6.5～7.5的Tris
‑
HCl缓冲液。
[0026]作为优选，本专利技术中洗脱液和再生液均为pH值为6.5～7.5的缓冲液。
[0027]作为优选，本专利技术的洗脱液和再生液均为含NaCl的Tris
‑
HCl缓冲液，且洗脱液中氯离子浓度小于再生液中氯离子浓度。
[0028]内毒素是带负电荷的脂多糖类物质，在pH>2时与阴离子交换剂有较强的结合力。在本专利技术接近中性的分离条件下，内毒素在离子交换色谱填料上的吸附强度远大于重组水
蛭素。所以，重组水蛭素在盐浓度较低的洗脱液作用下优先流出色谱柱，而后再用高盐浓度的再生液洗脱进行解吸附，使色谱柱中残留的的内毒素组分随再生液流出，实现重组水蛭素与内毒素杂质的有效分离。
[0029]进一步优选，本专利技术的洗脱液中，NaCl的浓度为100～150mmol/L，Tris
‑
HCl的浓度为8～20mmol/L。
[0030]进一步优选，本专利技术的再生液中，NaCl的浓度为1.0～2.0mol/L，Tris
‑
HCl的浓度为8～20mmol/L。
[0031]作为优选，本专利技术所用的重组水蛭素蛋白溶液为对重组水蛭素发酵液进行纯化制得，纯度≥95％。
[0032]作为优选，本专利技术的进样流速为70～100ml/min。
[0033]作为优选，本专利技术用再生液洗脱后，还需用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无内毒素水蛭素抗凝真空采血管，其特征在于，在真空采血管的内壁上涂有重组水蛭素，100μg重组水蛭素中内毒素含量＜0.25EU/ml。2.根据权利要求1所述的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管，其特征在于，重组水蛭素为采用阴离子交换色谱法对重组水蛭素蛋白液进行分离得到。3.一种如权利要求2所述的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、用超声波对采血管进行清洗、干燥；S2、在采血管内壁表面涂覆硅化剂，高温固化硅化剂；S3、用环氧乙烷对采血管进行灭菌，并去除残留环氧乙烷；S4、采用阴离子交换色谱法去除重组水蛭素中的内毒素，并用无热源的注射用水稀释，并除菌过滤，得到无菌、无内毒素的水蛭素抗凝剂；S5、在无菌环境下，在采血管内壁喷涂水蛭素抗凝剂，干燥后，对采血管抽真空并密封。4.根据权利要求3所述的无内毒素水蛭素抗凝真空采血管的制备方法，其特征在于，阴离子交换色谱法具体包括如下步骤：进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；柱再生：用再生液进行等...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛君，陈平，李浛民，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：