一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法技术

本发明专利技术涉及生物医药的分离纯化技术领域，具体涉及一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，采用阴离子交换色谱法进行分离，包括如下步骤：进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。本发明专利技术根据重组水蛭素和内毒素在中性条件下与阴离子交换剂吸附作用的强弱，通过增加流动相中的盐浓度进行等度洗脱，通过进样量的调控来实现良好的去除效果，保证了较高的蛋白回收率，同时实现了色谱柱的再生，该方法简单、高效、成本低，适用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法
本专利技术涉及生物医药的分离纯化
，具体涉及一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法。
技术介绍
水蛭是我国传统中药，始载于《神农本草经》，具有破血、逐瘀、痛经之功效。从水蛭唾液腺里提取的水蛭素是一种抗凝血蛋白质，其对凝血酶具有极强的抑制作用，可用于抑制纤维蛋白原和血小板在损伤血管内的积累、预防血栓形成、治疗弥散性血管内凝血等疾病。相比肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物，水蛭素具有用量小、疗效高、不良反应少、安全性高等优点，具有很好的临床应用价值。天然水蛭素是由65-66个氨基酸残基组成的单链环肽化合物，分子量约为7000Da，其中N末端有3对二硫键，可绕叠成密集的环肽结构，其疏水结构域与凝血酶催化中心附近的非极性结合点互补，对蛋白质起稳定作用，而C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。由于水蛭素在水蛭中的含量有限，从水蛭中难以提取大量水蛭素，不能满足临床的使用要求，因而通过基因工程重组水蛭素成为国内外医药界的研究重点。重组水蛭素在第63位氨基酸Tyr残基上脱SO3-，其余结构与性质跟天然水蛭素基本相同。最早的重组水蛭素cDNA已于20世纪80年被成功克隆出来，至今重组水蛭素已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌及真核细胞等成功表达。如专利CN1420176A中合成的水蛭素基因在酵母工程菌中中获得了高水平表达，且发酵液中蛋白纯度较高。公开号为CN110684101A的专利申请提供的重组水蛭素的制备方法，可以得到大量分泌菌体，提高活性产物的表达。然而，目前的研究重点主要在重组水蛭素的制备和表达方面，而对进一步的分离和纯化研究则相对较少。借助于细菌或真菌等微生物表达发酵制得的重组水蛭素中，不仅存在宿主蛋白、色素、培养基等杂质组分，还有菌体裂解产生的内毒素，这类物质积累作用于人体会产生一系列毒性反应，如发热、炎症甚至休克等问题。因此，通过发酵培养制备的重组水蛭素必须通过合理的纯化工艺去除蛋白溶液中的内毒素，避免对人体健康造成危害。通常药品和生物制品都对内毒素有严格限制，而目前针对重组水蛭素去除内毒素的方法研究甚少。公开号为CN106834395A的专利申请利用发酵液上清液通过pH调节和上罐加热的处理方式，提高了重组水蛭素的蛋白纯度，并采用低温静置过滤去除杂蛋白和脂类物质，而内毒素属于脂多糖类成分，使用静置分离的方法难以有效去除，并且该方法分离流程复杂，得到的重组水蛭素蛋白回收率低，无法适用于工业化生产。因此，在水蛭素纯化工艺基础上，探索有效去除内毒素的方法仍具有很大的实际意义。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种简单高效、适用于大规模工业化生产的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，制得蛋白回收率高、安全性好的重组水蛭素。本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，采用阴离子交换高效液相色谱法进行分离，包括如下步骤：进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。阴离子交换色谱以离子交换剂作为分离固定相，同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合，如蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间，带相同电荷类型的离子会竞争性地结合与其电荷相反的固定相介质。本专利技术中，重组水蛭素与离子交换剂表面的吸附作用力较弱，洗脱时优先流出色谱柱，而与固定相吸附作用力强的内毒素成分需通过洗脱能力更强的再生液冲洗下来，该方法简单快捷，既有效除去重组水蛭素蛋白溶液中的内毒素杂质，同时又能实现色谱柱的再生，可用于再次上样分离，提高了色谱柱的使用寿命。阴离子交换色谱分离时的进样量对分离效果也有显著影响。由于色谱柱的最大载样量受到填料颗粒大小、填料表面键合密度、色谱柱尺寸等因素影响，进样量往往需要根据不同色谱柱的饱和吸附量来确定。但专利技术人在实践中发现，即使按照最大载样量进样，重组水蛭素蛋白的纯化回收和除杂的总效率并不高。而本专利技术的进样量远远小于色谱柱的最大载样量，这是由于进样量继续增大，虽然不会引起重组水蛭素蛋白回收率的下降，但内毒素的去除效果下降的非常大。而若进样量小于最大载样量的25％，则内毒素的去除效果明显提升，但重组水蛭素蛋白的回收率却会明显降低。因此本专利技术通过进样量的合理调控来实现重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的去除效果和最佳的水蛭素回收率。进一步优选，本专利技术中阴离子交换色谱的进样量为色谱柱最大载样量的30％。作为优选，本专利技术中阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基(DEAE)键合硅胶为固定相。作为优选，本专利技术中的平衡液、洗脱液和再生液均为pH值为6.5～7.5的缓冲液。作为优选，本专利技术的洗脱液和再生液均为含NaCl的Tris-HCl缓冲液，且洗脱液中氯离子浓度小于再生液中氯离子浓度。内毒素是带负电荷的脂多糖类物质，在pH>2时与阴离子交换剂有较强的结合力。在本专利技术接近中性的分离条件下，内毒素在离子交换色谱填料上的吸附强度远大于重组水蛭素。所以，重组水蛭素在盐浓度较低的洗脱液作用下优先流出色谱柱，而后再用高盐浓度的再生液洗脱进行解吸附，使色谱柱中吸附强的内毒素组分随再生液流出，实现重组水蛭素与内毒素杂质的有效分离。进一步优选，本专利技术的洗脱液中，NaCl的浓度为100～150mmol/L，Tris-HCl的浓度为8～20mmol/L。进一步优选，本专利技术的再生液中，NaCl的浓度为1.0～2.0mol/L，Tris-HCl的浓度为8～20mmol/L。作为优选，本专利技术所用的重组水蛭素蛋白溶液为对重组水蛭素发酵液进行纯化制得，纯度≥95％。作为优选，本专利技术的进样流速为70～100ml/min。作为优选，本专利技术的平衡液为浓度为8～20mmol/L、pH值为6.5～7.5的Tris-HCl缓冲液。作为优选，本专利技术用再生液洗脱后，还需用平衡液清洗，即可再次上样分离。本专利技术以阴离子交换剂进行色谱分离，分步增加流动相的盐浓度进行等度洗脱，结合力弱的重组水蛭素优先流出，再以高盐浓度解离内毒素，实现有效分离的同时完成了色谱柱的再生。本专利技术方法制得的重组水蛭素蛋白回收率可达95％以上，100μg重组水蛭素中内毒素含量≤0.25EU/ml。本专利技术相比于现有技术，具有如下有益效果：(1)本专利技术采用阴离子交换色谱法去除重组水蛭素蛋白溶液中的内毒素，通过进样量的调控来实现良好的去除效果，同时保证较高的蛋白回收率；(2)本专利技术根据重组水蛭素和内毒素在中性条件下与阴离子交换剂吸附作用的强弱，通过增加流动相中的盐浓度进行等度洗脱，吸附力弱的重组水蛭素优先流出，而作用力强的内毒素成分在高盐浓度的再生液作用下被解离；(3)本专利技术的方法简单、快捷、高效，在有效去除内毒素的同时保证了重组水蛭素蛋白的回收率，并实现了色谱柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，采用阴离子交换色谱法进行分离，包括如下步骤：/n进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；/n洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；/n柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。/n

【技术特征摘要】
1.一种去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，采用阴离子交换色谱法进行分离，包括如下步骤：
进样：取重组水蛭素蛋白溶液进样，进样量为色谱柱最大载样量的25～40％，用平衡液冲洗进行柱平衡；
洗脱：用洗脱液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到重组水蛭素洗脱液；
柱再生：用再生液进行等度洗脱，并收集流出部分，得到内毒素洗脱液。


2.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基键合硅胶为固定相。


3.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，平衡液、洗脱液和再生液均为pH值为6.5～7.5的缓冲液。


4.根据权利要求1所述的去除重组水蛭素蛋白溶液中内毒素的方法，其特征在于，洗脱液和再生液均为含NaCl的Tris-HCl缓冲液，且洗脱液中氯离子浓度小于再生液中氯离子浓度。


5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛君，陈平，李浛民，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33