一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法技术方案

本发明专利技术涉及天然食品防腐剂的分离技术领域，具体涉及一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法。所述色谱系统包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统；本发明专利技术基于乳酸链球菌发酵液中不同组分和疏水基团之间作用力不同实现分离，先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调至酸性，采用高流速动力使吸附作用力弱的Nisin快速流出色谱柱，而色素和异味物质吸附于介质表面，通过再生液洗脱进行解离。本发明专利技术方法克服了传统工艺的缺点，提高了食品级乳酸链球菌素的口感和质量，可实现快速和高效的分离，且无有机溶剂的残留，绿色环保，色谱柱使用寿命长，生产成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法
本专利技术涉及天然食品防腐剂的分离
，具体涉及一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法。
技术介绍
乳酸链球菌素(Nisin，尼辛)亦称乳酸链球菌肽，是乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的多肽类化合物，由34个氨基酸残基组成，其分子末端有氨基和羧基，氨基末端为异亮氨酸，羧基末端为赖氨酸，分子量约为3500Da。乳酸链球菌具有稳定、高效的抗菌活性，可被人体吸收利用，不会改变人体肠道内正常菌群，且不会产生如其他抗菌素出现的耐药性问题或交叉抗性。乳酸链球菌素能有效抑制食品腐败的多种革兰氏阳性菌，是食品保鲜防腐、延长货架期的良品，到目前为止，全世界已有五十多个国家和地区批准将乳酸链球菌素作为食品防腐剂，现已广泛应用于乳制品、罐头、海产品、肉制品等。此外，乳酸链球菌素在医疗卫生领域也有较大的应用前景，如高纯度的乳酸链球菌素对治疗母牛乳腺炎就有很好的疗效。目前，乳酸链球菌的发酵生产是获得乳酸链球菌素的唯一途径，但发酵产物组分复杂，对分离和纯化工艺有极高的要求，很难实现高纯度乳酸链球菌素的制备。并且，乳酸链球菌发酵产物通常会伴随令人不快的异味，加入到食品中也会影响食品的味道和口感，降低食用者接受度。同时乳酸链球菌发酵液中的色素若去除不完全，也会影响产品色泽和品质。因此，如何去除乳酸链球菌素的色素和异味也是其生产制备过程中十分重要的环节。但是另一方面，多肽类化合物在分离纯化后还存在回收率低的问题，一般多肽或蛋白质在纯化过程中容易受温度、pH值、缓冲液离子强度、溶剂等因素的影响，导致自身活性丧失。如公告号为CN100554276C的专利文献中建立了从含乳酸链球菌素的乳酸链球菌培养上清液中纯化乳酸链球菌素，虽然提高了纯度和得率，但活性多肽的总回收率仅能达到57％左右，可见其乳酸链球菌素在纯化操作中丧失了部分活性。而传统去除乳酸链球菌素色素和异味的工艺也存在较多缺点，如泡沫吸附法的活性回收率低，溶剂萃取法对环境污染较大且容易有溶剂残留，盐析法去除杂质不完全，仍有大量杂蛋白和色素残留。因此，在完全去除色素和异味的基础上保证多肽的活性和稳定性，仍然是乳酸链球菌素纯化工艺面临的难题。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种快速高效、绿色环保的去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统及方法，同时使得到的乳酸链球菌素具有较高的活性回收率。本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统，其中，色谱柱采用苯基键合硅胶介质。作为优选，本专利技术色谱柱的介质采用高压匀浆法进行填充。作为优选，本专利技术的可再生色谱系统中，进液系统包括进样管、进样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门，出液系统包括出样管、出样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门。本专利技术的可再生色谱系统可利用吸附-穿透法分离Nisin与其发酵液中的色素、异味等杂质。先通过高压匀浆法将苯基键合硅胶介质填充于色谱柱中，作为疏水作用色谱的固定相，进样后由于乳酸链球菌素在该介质上的吸附作用力弱，可优先穿出色谱柱，而疏水作用力强的杂蛋白、色素、异味成分等杂质组分吸附于色谱柱介质表面，则需在完成分离后用再生液进行清洗解离，从而实现高效分离。而目前普遍采用盐析、泡沫吸附法等对乳酸链球菌素进行粗分离，但盐析法往往残留大量杂蛋白及色素成分，泡沫吸附法不仅分离效率低，还会导致Nisin的活性回收率偏低，表面活性剂的用量较大，材料回收和再利用存在问题，不适于绿色经济的工业生产。此外，用C18色谱柱作为固定相进行反相层析分离也是Nisin纯化常用工艺，但C18硅胶柱介质表面的烷基链长度对蛋白质、多肽类物质的吸附保留和活性回收有很大影响，烷基链越长，固定相疏水性越强，蛋白质和多肽与固定相的结合力越强，Nisin易被吸附无法直接穿出色谱柱，需增加流动相有机溶剂的洗脱浓度才能使Nisin顺利洗脱，而有机溶剂会引起多肽链聚集，导致蛋白分子生物活性丧失并不可逆吸附。而本专利技术采用了表面键合苯基的硅胶基质，其疏水性相对C18柱较弱，因而在分离时Nisin几乎不吸附于色谱柱介质表面，可减少有机溶剂的使用，避免Nisin失活和溶剂残留，保证产品质量的同时有利于节约资源和成本，减少环境污染。并且，Nisin和色素等杂质组分在疏水层析作用中有较大的选择性差异，采用苯基键合硅胶色谱柱比C18柱分离的效果更好，提纯比活性和回收率也更高。作为优选，本专利技术的检测器为UV检测器。本专利技术还提供一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，采用上述的可再生色谱系统对乳酸链球菌发酵液进行分离，依次包括前处理、进样、收集、柱再生。作为优选，本专利技术现对样品进行前处理，具体操作为：将用于分离的乳酸链球菌发酵液先调节pH值至2.0～4.0，再离心，弃去沉淀，得到上清液。作为优选，本专利技术的乳酸链球菌发酵液进样的流速为250～330mL/min。本专利技术采用苯基键合硅胶填料作为疏水层析的分离介质，基于乳酸链球菌发酵液中不同组分与疏水基团的作用力不同进行分离。先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调至酸性，进样洗脱时，作用力弱的Nisin基本不保留，在高流速动力下直接穿出色谱柱，而发酵液中作用力强的蛋白类杂质、色素及异味物质则吸附于介质表面，在完成分离后通过再生液洗脱解离。本专利技术采用高流速进样，可使进样后Nisin快速穿出色谱柱，大大缩短分离工艺流程和制备周期，有利于实现工业化快速生产。但若进样流速较低，增加样品溶液在在色谱柱中的停留时间，可能增加Nisin在分离介质表面的吸附，减少其穿出量，降低活性回收率；而同时，进样流速不宜过高，当流速超过330mL/min时，色素和异味物质在色谱柱内停留时间较短，可能造成在分离介质上吸附不完全的问题，影响分离效果，得到的Nisin溶液中色素和异味去除不完全。作为优选，本专利技术中分离样品的收集为：用pH值为2.0～4.0的平衡液进行洗脱。进一步优选，本专利技术所述的平衡液为乙酸钠-乙酸缓冲液、柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液、乳酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液中的至少一种。作为优选，本专利技术中柱再生使用的再生液为pH值为2.0～4.0的50～70％乙醇。作为优选，采用本专利技术的色谱系统和方法进行除杂，分离得到的Nisin溶液澄清透明，且无异味，活性回收率≥95％。本专利技术相比于现有技术，具有如下有益效果：(1)本专利技术采用一种高效疏水层析色谱系统，以苯基键合硅胶作为色谱柱介质，基于不同组分与疏水基团之间的不同作用力，先将低离子强度的乳酸链球菌发酵液调至酸性，作用力弱的Nisin基本不保留优先穿出色谱柱，而作用力强的色素和异味成分吸附于介质表面，从而有效去除乳酸链球菌素中的色素和异味杂质；(2)本专利技术采用高流速动力穿出的方法，使Nisin快速流出色谱柱，大大缩短分离工艺流程和制备周期，有利于实现工业化快速生产；(3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统，其特征在于，色谱柱采用苯基键合硅胶介质。/n

【技术特征摘要】
1.一种去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，包括进液系统、高压输液泵、混合器、过滤保护柱、色谱柱、检测器、出液系统，其特征在于，色谱柱采用苯基键合硅胶介质。


2.根据权利要求1所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的可再生色谱系统，其特征在于，进液系统包括进样管、进样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门，出液系统包括出样管、出样阀门、平衡液管、平衡液阀门、再生液管和再生液阀门。


3.一种去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其特征在于，采用如权利要求1或2所述的可再生色谱系统对乳酸链球菌发酵液进行分离，依次包括前处理、进样、收集、柱再生。


4.一种如权利要求3所述的去除乳酸链球菌素色素和异味的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛君，陈平，李浛民，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33