一种高纯度重组水蛭素的纯化方法技术

本发明专利技术涉及生物医药的分离技术领域，具体涉及一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。本发明专利技术结合疏水层析和阴离子交换层析两种液相色谱，通过梯度洗脱实现重组水蛭素与杂质组分的分离，有效去除重组水蛭素发酵液中的内毒素和宿主蛋白，制得高纯度高比活的重组水蛭素，本发明专利技术的方法选择性好、分辨率高、分离速度快，避免了有机溶剂对人体和环境的危害，降低了成本，稳定性和安全性好，适用于大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种高纯度重组水蛭素的纯化方法
本专利技术涉及生物医药的分离
，具体涉及一种高纯度重组水蛭素的纯化方法。
技术介绍
水蛭是我国传统中药，始载于《神农本草经》，具有破血、逐瘀、痛经之功效。从水蛭唾液腺里提取的水蛭素是一种抗凝血蛋白质，其对凝血酶具有极强的抑制作用，可用于抑制纤维蛋白原和血小板在损伤血管内的积累、预防血栓形成、治疗弥散性血管内凝血等疾病。相比肝素、阿司匹林等传统的抗凝药物，水蛭素具有用量小、疗效高、不良反应少、安全性高等优点，具有很好的临床应用价值。天然水蛭素是由65-66个氨基酸残基组成的单链环肽化合物，分子量约为7000Da，其中N末端有3对二硫键，可绕叠成密集的环肽结构，其疏水结构域与凝血酶催化中心附近的非极性结合点互补，对蛋白质起稳定作用，而C末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键。由于水蛭素在水蛭中的含量有限，从水蛭中难以提取大量水蛭素，不能满足临床的使用要求，因而通过基因工程重组水蛭素成为国内外医药界的研究重点。重组水蛭素在第63位氨基酸Tyr残基上脱SO3-，其余结构与性质跟天然水蛭素基本相同。最早的重组水蛭素cDNA已于20世纪80年被成功克隆出来，至今重组水蛭素已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌及真核细胞等成功表达。如专利CN1420176A中合成的水蛭素基因在酵母工程菌中中获得了高水平表达，且发酵液中蛋白纯度较高。公开号为CN110684101A的专利申请提供的重组水蛭素的制备方法，可以得到大量分泌菌体，提高活性产物的表达。然而，目前的研究重点主要在重组水蛭素的制备和表达方面，而对进一步的分离和纯化研究则相对较少。传统将发酵液加热后放入发酵罐中的处理方式不适于工业化生产，并且采用低温离心去除杂质的可操作性差，且蛋白纯度低、色素含量高。公开号为CN106834395A的专利申请利用发酵液上清液通过pH调节和上罐加热的处理方式，提高了重组水蛭素的蛋白纯度，并采用低温静置过滤去除杂蛋白和脂类物质，但该方法分离流程复杂，且静置分离的效率太低，总活性回收率也较低。公开号为CN104761635A的专利申请采用了膜过滤结合色谱分离技术对天然水蛭素进行分离纯化，但分别采用陶瓷滤膜、有机滤膜和纳滤膜过滤不仅导致水蛭素活性回收率偏低，而且其中纳滤膜起到浓缩作用，但纯度并未提高，并降低了水蛭素的疏水性，在纳滤后再经过反相色谱洗脱，大大降低了水蛭素在反相色谱柱上的吸附作用力，严重影响分离效果。此外，目前反相色谱分离大多采用乙腈、甲醇等有机溶剂，不仅会破坏蛋白质分子结构，导致活性损失，还可能存在溶剂残留，对人体和环境都造成危害。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种简单高效、节能环保且适用于大规模工业化生产的重组水蛭素的纯化方法，可制得具有高纯度、高比活、高回收率的重组水蛭素。本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实施：一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相；阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基(DEAE)键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。本专利技术先以温和的疏水层析作用，在保持水蛭素蛋白分子结构完整和活性稳定的同时去除部分杂质，再通过阴离子交换色谱去除残留的宿主杂蛋白，分别以盐溶液为流动相进行线性梯度洗脱，得到高纯度的重组水蛭素。蛋白质在分离纯化过程中极易受到温度、搅拌、酸碱度、有机溶剂等物理化学因素的影响发生变性，导致回收率低甚至失活。而疏水层析是一种相对温和的纯化方法，重组水蛭素经过疏水色谱分离可保持蛋白分子的结构和活性稳定，其活性回收率可达80％以上。本专利技术以键合苯基基团的硅胶基质作为疏水色谱固定相，重组水蛭素发酵液中的各组分与固定相疏水基团之间的作用力不同而实现分离。目前普遍采用的碳十八烷基硅胶填料，其表面的烷基链长度对蛋白质、多肽类物质的吸附保留和活性回收有很大影响，烷基链越长，固定相疏水性越强，蛋白质和多肽与固定相的结合力越强，为使水蛭素蛋白顺利洗脱需增加流动相有机溶剂的洗脱浓度，而有机溶剂会引起多肽链聚集，导致蛋白分子不可逆吸附和生物活性丧失并。而本专利技术使用的苯基键合硅胶的疏水性相对C18硅胶柱较弱，重组水蛭素和杂质成分在疏水分离时的选择差异性更大，分辨率更好，提纯比活性和回收率更高。作为优选，本专利技术的预处理包括：先将重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5～3.5进行酸沉，再取上清液加热至76～83℃恒温保存5～10min，再用冰水浴降温，得到粗提重组水蛭素。进一步优选，将酸沉后的上清液加热至80℃恒温保存8～10min。重组水蛭素的等电点为3.9，将pH值调节至2.5～3.5可使多肽释放质子而带负电，此时可除去部分杂质，再经过热处理除去热不稳定蛋白质。重组水蛭素蛋白分子在80℃条件下的活性可维持10min左右，因而热处理时间不得超过10min，再在热处理后需立即用冰水浴降温。作为优选，疏水色谱以流动相A-流动相B作为流动相，其中，流动相A为pH值为4.5～5.5的氯化钠-磷酸盐缓冲液，流动相B为pH值为4.5～5.5的磷酸盐缓冲液。进一步优选，疏水色谱的洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B。本专利技术以不同浓度的盐溶液作为混合流动相进行梯度洗脱，其中流动相A含有氯化钠，因而开始洗脱时盐浓度较高，在洗脱过程中流动相中氯化钠浓度逐渐降低。通过增加盐浓度，可增强重组水蛭素与固定相介质表面产生较强的相互作用力而被吸附，随着梯度洗脱程序降低盐浓度，从而实现重组水蛭素的解吸附。发酵培养基成分、色素、宿主蛋白等疏水性低的杂质在高盐浓度洗脱下优先流出，随后重组水蛭素蛋白在低盐浓度流动相作用下被洗脱，部分疏水性更强的杂质仍然保留需通过再生液洗脱。进一步优选，疏水色谱的流动相A中，氯化钠的浓度为0.08～1.5mol/L。进一步优选，疏水色谱的流动相A和流动相B中，磷酸盐的浓度均为30～60mmol/L。作为优选，粗提重组水蛭素进行疏水色谱分离时的进样流速为70～100mL/min。进一步优选，进样后先用流动相A进行柱平衡，再根据洗脱程序进行洗脱。作为优选，疏水色谱分离时，流动相的洗脱速度为70～100mL/min。作为优选，在洗脱程序完成后，用再生液I进行洗脱，完成疏水色谱的柱再生。进一步优选，再生液I为70％～90％乙醇。在完成重组水蛭素洗脱液I的收集之后，用再生液进行柱再生，可以洗去结合于分离介质表面吸附力强的组分，避免杂质残留污染色谱柱，有助于延长色谱柱使用寿命。并且柱再生用的乙醇易于回收利用，污染小，节能环保，可进一步降低生产成本。作为优选，阴离子交换色谱以流动相A-流动相B作为流动相，其中，流动相A为pH值为6.5～7.5的Tris-HCl缓冲液，流动相B为pH值为6.5～7.5的NaC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，其特征在于，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相；阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。/n

【技术特征摘要】
1.一种高纯度重组水蛭素的纯化方法，其特征在于，取重组水蛭素发酵液，经过预处理后，先采用疏水色谱分离，收集重组水蛭素洗脱液I，再采用阴离子交换色谱进行分离，收集重组水蛭素洗脱液II，干燥，得到高纯度重组水蛭素，其中，疏水色谱以苯基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相；阴离子交换色谱以二乙基氨基乙基键合硅胶为固定相，以盐溶液为流动相。


2.根据权利要求1所述的高纯度重组水蛭素的纯化方法，其特征在于，预处理包括：先将重组水蛭素发酵液的pH值调节至2.5～3.5进行酸沉，再取上清液加热至76～83℃恒温保存5～10min，得到粗提水蛭素，再用冰水降温，得到粗提重组水蛭素。


3.根据权利要求1所述的高纯度重组水蛭素的纯化方法，其特征在于，疏水色谱以流动相A-流动相B作为流动相，其中，流动相A为pH值为4.5～5.5的氯化钠-磷酸盐缓冲液，流动相B为pH值为4.5～5.5的磷酸盐缓冲液。


4.根据权利要求3所述的高纯度重组水蛭素的纯化方法，其特征在于，疏水色谱的洗脱程序为：0-120min：100％→0％流动相A，0％→100％流动相B。


5.根据权利要求3所述的高纯度重组水蛭...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛君，陈平，李浛民，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33