一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，包括如下步骤：(1)PCR扩增目的基因；(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切；(3)IFNα2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)。干扰素α2b表达菌株破菌后，经硫酸铵沉淀，四步离子交换和疏水层析、以及超滤等分离纯化。本发明专利技术表达和纯化的重组人干扰素具有良好的效率、回收率和活性，产品质量远高于国家药典规定的质量标准。产品质量远高于国家药典规定的质量标准。产品质量远高于国家药典规定的质量标准。

【技术实现步骤摘要】
一种干扰素
α
2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物标志物检测
，具体涉及一种干扰素α2b重组表达质粒的构建、可溶性重组表达、分离纯化方法及其应用。

技术介绍

[0002]干扰素α2b是干扰素α2的一个亚型，在众多的人干扰素种类中，干扰素α的抗病毒活性最强，是临床上治疗肿瘤最常用的干扰素。干扰素α至少含有13种亚型，其中干扰素α2(α2a和α2b)被广泛用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣和某些白血病、恶性肿瘤等疾病。近年来，干扰素α2b被用于COVID
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19病毒感染的患者，显示出较好的疗效。
[0003]人IFNα2b(UniProtKB数据库编号：P01563)全长188个氨基酸，其中1～23号氨基酸是信号肽，成熟蛋白中信号肽是要被去除的，一般所说的人IFNα2b也就是由24～188这165个氨基酸组成。
[0004]干扰素α2b的分子量在19kD左右，pI为6.0左右，生理条件下带负电。与II型干扰素对酸敏感不同的是，I型干扰素，包括干扰素α2b，具有耐酸性[10]，在pH 2.0～10.0中很稳定。干扰素α2b对热也是比较稳定的，在
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20℃下可长期稳定保存。
[0005]重组人干扰素α2b作为一种上市药物，被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗，产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的干扰素都是经过基因工程表达生产，并且以大肠杆菌表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素α2b以包涵体的形式表达，包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低，纯化时需要经过四步色谱处理，工艺繁琐，成本高，而且无法去除未完全复性的中间产物，从而影响产品质量和疗效。
[0006]建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺，并建立其在此基础上的高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵罐发酵获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵，收集菌体后，通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、Q Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Octyl Sepharose Fast Flow疏水层析进行纯化，并对纯化产物进行生物活性分析。
[0007]重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度OD600达到38.5，可溶性重组人干扰素α2b占菌体总蛋白的14.0％；100克湿菌可平均纯化获得240mg纯度接近100％的重组人IFNα2b，比活为1.81x108IU/mg。
[0008]干扰素α2b在临床上具有广泛的应用，但是其大规模生产一直是一个难题。目前，国内工业化生产的rIFNα2b大多是以不溶性包涵体表达，以包涵体变复性为纯化手段，经过包涵体清洗、离心、复性、离心、层析等手段获得原液。在包涵体变复性工艺中，复性操作困难，活性损失大、复性耗时长，生产成本高，设备投资大等缺点，而且复性机理复杂，过程难以控制。因此，rIFNα2b在产品的均一性和批间一致性等方面都存在着不小的挑战。而且，在变复性工艺中需要加入变性剂和氧化还原系统，增加了杂质的加入，提高了质控的难度；因此，以包涵体变复性工艺生产的重组干扰素α2b通常无法达到欧盟的质量标准。开发高质量
的重组干扰素α2b的表达和生产工艺、建立快速稳定的纯化工艺势在必行。

技术实现思路

[0009]针对上述缺陷，本专利技术提供了一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用。
[0010]为了达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术的一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，包括如下步骤：
[0011](1)PCR扩增目的基因：引物设计及目的基因的PCR扩增；设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段，上游引物和下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点；PCR方法对IFNα2b基因片段进行扩增；
[0012](2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析；胶回收目的基因片段及载体片段，然后用T4 DNA连接酶将载体和目的片段连接；
[0013](3)IFNα2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，以菌落PCR进行阳性克隆筛选；菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，同时进行基因测序，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)；
[0014](4)干扰素α2b的纯化:step1 IFNα2b的粗提；Step2 IFNα2b的层析纯化。
[0015]进一步地，在步骤(1)中，所述的上游引物IFNα2b
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F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的下游引物IFNα2b
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R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
[0016]进一步地，在步骤(1)中，所述的PCR反应体系为：2x Tris Buffer 25μL，dNTP Mix(10μM each)1μL，Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，Template DNA 1.5μL，50x PCR Enhancer 1μL，High
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Fidelity DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 19μL，共50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃再延伸7min；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0017]更进一步地，在步骤(2)中，以T4 DNA连接酶于22℃连接1.5h；在步骤(4)中，IFNα2b的粗提:S1菌体裂解：将约300g湿菌体用3000ml裂解液(50mmol/L NH4Cl，5mol/L EDTA，pH8.0)重悬，1200bar高压裂解三次，10000g的离心力离心50min，取上清；
[0018]S2硫酸铵沉淀：取裂解上清边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为25％，继续搅拌60min；12000g的离心力离心30min，取上清；上清中边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为55％，继续搅拌60min，12000g的离心力离心30min，留蛋白沉淀。
[0019]进一步地，在步骤(4)中，IFNα2b的层析纯化包括如下步骤：S1样品处理；S2 Phenyl Sepharose Fast Flow层析；S3脱盐；S4 Q Sepharose Fast Flow层析；，S5更换缓冲液；S6 SP Sepharose Fast Flow层析；S7 Oct本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)PCR扩增目的基因：引物设计及目的基因的PCR扩增；设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段，上游引物和下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点；PCR方法对IFNα2b基因片段进行扩增；(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析；胶回收目的基因片段及载体片段，然后用T4 DNA连接酶将载体和目的片段连接；(3)IFNβ2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，以菌落PCR进行阳性克隆筛选；菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，同时进行基因测序，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)；(4)干扰素α2b的纯化:step1 IFNα2b的粗提；Step2 IFNα2b的层析纯化。2.根据权利要求1所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的上游引物IFNα2b
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F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的下游引物IFNα2b
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R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的PCR反应体系为：2x Tris Buffer 25μL，dNTP Mix(10μM each)1μL，Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，Template DNA 1.5μL，50x PCR Enhancer 1μL，High
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Fidelity DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 19μL，共50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃再延伸7min；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。4.根据权利要求3所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，以T4 DNA连接酶于22℃连接1.5h；在步骤(4)中，IFNα2b的粗提:S1菌体裂解：将约300g湿菌体用3000ml裂解液(50mmol/L NH4Cl，5mol/L EDTA，pH8.0)重悬，1200bar高压裂解三次，10000g的离心力离心50min，取上清；S2硫酸铵沉淀：取裂解上清边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为25％，继续搅拌60min；12000g的离心力离心30min，取上清；上清中边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为55％，继续搅拌60min，12000g的离心力离心30min，留蛋白沉淀。5.根据权利要求4所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，其特征在于：在步骤(4)中，IFNα2b的层析纯化包括如下步骤：S1样品处理；S2 Phenyl Sepharose Fast Flow层析；S3脱盐；S4 Q Sepharose Fast Flow层析；，S5更换缓冲液；S6 SP Sepharose Fast Flow层析；S7 Octyl Sepharose Fast Flow纯化；S8超滤更换缓冲液；在步骤(4)中，S1样品处理:取硫酸铵沉淀样品，加入10倍体积的缓冲液A，溶解后，加入10倍体积的缓冲液B，搅拌10分钟，12000g的离心力离心30min，，取上清备用；缓冲液A为20mM PB、pH 7.0；缓冲液B为20mM PB、2.4M硫酸铵、pH 7.0；S2 Phenyl Sepharose Fast Flow层析:先用2
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3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用2
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3个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用5
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【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，胡敏进，
申请(专利权)人：江苏靶标生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：