一种糜蛋白酶提取生产工艺制造技术

发明专利技术公开了一种糜蛋白酶提取生产工艺，它依次包括酸浸提取、超滤浓缩、盐析结晶、酶原激活、除杂脱盐、亲和层析、浓缩干燥步骤；酶原激活步骤是将滤饼用去离子水溶解并加入240～260g氯化钙和0.2～0.3g激活剂，调整pH到7.5～8.5，在2～8℃温度条件下酶解，得到含有杂质的糜蛋白酶混合溶液；将糜蛋白酶混合溶液经过板框过滤、20KD超滤膜过滤、5KD的超滤膜，获得糜蛋白酶脱盐溶液；将糜蛋白酶脱盐溶液经过亲和层析，得到糜蛋白酶溶液。它生产成本低，糜蛋白酶生物活性和纯度高。酶生物活性和纯度高。

【技术实现步骤摘要】
一种糜蛋白酶提取生产工艺


[0001]本专利技术属于生物制药
，尤其是一种糜蛋白酶提取生产工艺。

技术介绍

[0002]糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面：一是、消炎：对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二是、抗癌：能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，有报道在抗癌增效上有效率超过50％，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。
[0003]我国专利200610117613.9 公开了“高纯度糜蛋白酶的制备方法”，它采用酸浸、过滤、盐析和层析分离等步骤制备糜蛋白酶，其特征是以进口GE Health 凝胶介质为基础，接上慈菇蛋白酶抑制剂作为配基得到亲和层析介质。其缺点是凝胶介质昂贵，可重复使用次数少，产品收率低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种糜蛋白酶提取生产工艺，该工艺生产成本低，可提高了糜蛋白酶生物活性和纯度。
[0005]本专利技术的目的通过下述技术方案解决：一种糜蛋白酶提取生产工艺，它包括以下步骤：（1）酸浸提取：将牛胰腺粉碎、酸浸、过滤，得到胰腺提取液；（2）超滤浓缩：将牛胰腺提取液通过5KD超滤膜过滤，收集截流液，得到浓缩胰腺提取液；（3）盐析结晶：将浓缩胰腺提取液加入硫酸铵，经过结晶析出和过滤，得到含有糜蛋白酶原的滤饼；（4）酶原激活：将滤饼用3～5倍去离子水溶解成滤饼水溶液，在滤饼水溶液中，每公斤滤饼加入240～260g氯化钙和0.2～0.3g激活剂，用NaOH调整pH到7.5～8.5，在2 ～ 8℃温度条件下酶解；每隔60～100分钟监测溶液活性，当胰蛋白酶活力≥2000u/mg，并且糜蛋白酶活力≥400u/mg时，加入盐酸溶液调节pH到2～3，终止激活，得到含有杂质的糜蛋白酶混合溶液；（5）除杂脱盐：先将糜蛋白酶混合溶液通过板框过滤，滤除硫酸钙等沉淀物，得糜蛋白酶除杂溶液；再将糜蛋白酶除杂溶液通过分子量20KD超滤膜过滤，除去20000以上分子量的物质, 得糜蛋白酶净化溶液；然后将糜蛋白酶净化溶液通过分子量5KD的超滤膜和去离子水进行超滤脱盐，使膜内糜蛋白酶净化溶液电导率小于1200s/cm，获得糜蛋白酶脱盐溶液；（6）亲和层析：用DEAE琼脂糖凝胶介质装层析柱，用缓冲液进行平衡，平衡后用糜蛋白酶浓缩溶液直接上样，用缓冲液洗柱，洗至流出液OD280的值小于0.1，洗柱之后用洗脱
液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为糜蛋白酶溶液；（7）浓缩干燥：将糜蛋白酶溶液通过5KD超滤膜脱盐浓缩，使糜蛋白酶溶液电导率小于2000～3000s/cm，再经过冷冻真空干燥，即得糜蛋白酶成品。
[0006]优先的，在步骤（1）中，酸浸提取包括以下具体步骤：选取新鲜冷冻牛胰腺，经切片机切片后，粉碎成胰腺肉糜；将胰腺肉糜加入到提取罐中，加入胰腺肉糜3～5倍体积的水，按每公斤胰腺肉糜加入95～98%的浓硫酸8～12毫升、 氯化钠46～50克，控制温度为10～16℃，提取12～18小时，得胰腺酸浸液；将胰腺酸浸液采用离心过滤，收集离心滤液；在离心滤液中加入助滤剂采用板框压滤，收集板框滤液即为胰腺提取液。
[0007]优先的，在步骤（3）中，按每10L胰腺提取液加入硫酸铵4～6Kg的比例投料，将硫酸铵加入到胰腺提取液中，搅拌溶解，静止40～80分钟；使糜蛋白酶原充分结晶，过滤得到含有糜蛋白酶原的滤饼。
[0008]优先的，在步骤（4）中，所述的激活剂为高纯度的胰蛋白酶，活性＞ 3300u/mg。
[0009]优先的，在步骤（6）中，所述的缓冲液为0.02mol/L乙酸；所述的洗脱液为：0.02mol/L磷酸二氢钠－0.02mol/L磷酸氢二钠。
[0010]本专利技术和现有技术相比的优点为：（1）本专利技术采用DEAE琼脂糖凝胶介质装层析柱，DEAE琼脂糖凝胶是一种将二乙胺基乙基键合在琼脂糖微球上形成的带有弱碱阴离子基团的层析分离介质。DEAE琼脂糖凝胶保留了琼脂糖极好的亲水性及大网架结构,与生物活性大分子有很好的相容性,具有离子交换容量高，特异性吸附少和流速快等特点。采用DEAE琼脂糖凝胶介质可以一步从糜蛋白酶原酶解液中纯化糜蛋白酶，操作方便，专一性更好，糜蛋白酶效价更高。
[0011]（2）本专利技术采用高纯度的胰蛋白酶为激活剂，并定时监测溶液活性，当胰蛋白酶活力≥2000u/mg并且糜蛋白酶活力≥400u/mg时，终止酶解，大大提高糜蛋白酶的活性，最终产品活力达到1500u/mg 以上；按照分子激活规律进行酶解，操作更为准确、科学；大大缩短工作时间，降低生产成本。
[0012]（3）本专利技术在在步骤（2）、步骤（5）和步骤（7）中，都采用了超滤浓缩技术，通过5KD超滤膜过滤可以除去小于5000分子量的物质和盐类，通过20KD超滤膜过滤可以除去大于20000以上分子量的物质，最终保留了分子量在5000～20000之间的目标产品，为了规模化、产业化生产，缩短生产时间，提高生产效率，也节约胶的使用寿命。
[0013]（3）本专利技术在生产过程中，有效地实现蛋白酶活性的保护，最终产品的活性和回收率较高，糜蛋白酶活性为1500u/mg，每吨原料产出3.2～3.5kg ；糜蛋白酶的活性都符合中国药典、欧洲药典EP5.0 和美国药典USP3.0 的要求。
具体实施方式
[0014]为使本专利技术的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详细的描述。
[0015]实施例1：一种糜蛋白酶提取生产工艺，它包括以下步骤：（1）酸浸提取：
①
选取新鲜冷冻牛胰腺，经切片机切片后，粉碎成胰腺肉糜；
②
将胰腺肉糜加入到提取罐中，加入胰腺肉糜4倍体积的水，按每公斤胰腺肉糜加入98%的浓硫酸9毫升、 氯化钠48克，控制温度为13℃，提取15小时，得胰腺酸浸液；
③
将胰腺酸浸液采用离心过滤，收集离心滤液；在离心滤液中加入助滤剂采用板框压滤，收集板框滤液即为胰腺提取液。
[0016]（2）超滤浓缩：将牛胰腺提取液通过5KD超滤膜过滤，收集截流液，得到浓缩胰腺提取液；（3）盐析结晶：按每10L胰腺提取液加入硫酸铵5Kg的比例投料，将硫酸铵加入到胰腺提取液中，搅拌溶解，静止60分钟；使糜蛋白酶原充分结晶，过滤得到含有糜蛋白酶原的滤饼。
[0017]（4）酶原激活：将滤饼用4倍去离子水溶解成滤饼水溶液，在滤饼水溶液中，每公斤滤饼加入250g氯化钙和0.2～0.3g活性＞ 3300u/mg的高纯度的胰蛋白酶激活剂，用NaOH调整pH到8，在2 ～ 8℃温度条件下酶解；每隔80分钟监测溶液活性，当胰蛋白酶活力≥2000u/mg，并且糜蛋白酶活力≥400u/mg时，加入盐酸溶液调节pH到2.5，终止激活，得到含有杂质的糜蛋白酶混合溶液；（5）除杂脱盐：先将糜蛋白酶混合溶液通过板框过滤，滤除硫酸钙等沉淀物，得糜蛋白酶除杂溶液；再将糜蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糜蛋白酶提取生产工艺，它包括以下步骤：（1）酸浸提取：将牛胰腺粉碎、酸浸、过滤，得到胰腺提取液；（2）超滤浓缩：将牛胰腺提取液通过5KD超滤膜过滤，收集截流液，得到浓缩胰腺提取液；（3）盐析结晶：将浓缩胰腺提取液加入硫酸铵，经过结晶析出和过滤，得到含有糜蛋白酶原的滤饼；（4）酶原激活：将滤饼用3～5倍去离子水溶解成滤饼水溶液，在滤饼水溶液中，每公斤滤饼加入240～260g氯化钙和0.2～0.3g激活剂，用NaOH调整pH到7.5～8.5，在2 ～ 8℃温度条件下酶解；每隔60～100分钟监测溶液活性，当胰蛋白酶活力≥2000u/mg，并且糜蛋白酶活力≥400u/mg时，加入盐酸溶液调节pH到2～3，终止激活，得到含有杂质的糜蛋白酶混合溶液；（5）除杂脱盐：先将糜蛋白酶混合溶液通过板框过滤，滤除硫酸钙等沉淀物，得糜蛋白酶除杂溶液；再将糜蛋白酶除杂溶液通过分子量20KD超滤膜过滤，除去20000以上分子量的物质, 得糜蛋白酶净化溶液；然后将糜蛋白酶净化溶液通过分子量5KD的超滤膜和去离子水进行超滤脱盐，使膜内糜蛋白酶净化溶液电导率小于1200s/cm，获得糜蛋白酶脱盐溶液；（6）亲和层析：用DEAE琼脂糖凝胶介质装层析柱，用缓冲液进行平衡，平衡后用糜蛋白酶浓缩溶液直接上样，用缓冲液洗柱，洗至流出液OD280的值小于0.1，洗柱之后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰，所得溶液即为糜蛋白酶溶液；（7）浓缩干燥：将糜蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文浩，包前德门，李相超，陈美欣，边静，
申请(专利权)人：赤峰市云淞科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：