一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD‑L1基因突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、PD‑L1（人）一抗、山羊抗人IgG/HRP、0.1%Triton X‑100、0.3%H

【技术实现步骤摘要】
一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
肺癌是导致癌症患者死亡的主要恶性肿瘤之一，在我国，肺癌的发病率和死亡率均居第一位。小细胞肺癌（smallcelllungcancer，SCLC）约占肺癌发生率的15％～20％，相较非小细胞肺癌，具有更快的肿瘤倍增时间，快速生长以及易于早期转移的特点。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。随着分子生物学的发展，PD-1/PD-L1为免疫靶点的免疫疗法为小细胞肺癌治疗带来了新的曙光。研究发现，免疫抑制与免疫逃逸和肿瘤细胞PD-L1的过表达密切相关，肿瘤细胞可通过其表面的PD-L1与免疫细胞T细胞表面的PD-1结合，传导抑制性信号，使得T细胞不能识别肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号，导致了肿瘤细胞免疫逃逸。基于此理论提出假设，自原发灶脱落进入循环系统的循环肿瘤细胞(CTC)出现凋亡、免疫清除或存活、转移结局与PD-L1表达密切相关。PD-1或PD-L1免疫制剂的疗效多与肿瘤组织中PD-L1的免疫组化表达水平有关，提示PD-L1表达水平可能是预测PD-1免疫治疗疗效的生物标志物；还有研究表明小细胞肺癌组织中PD-L1的高表达与肿瘤侵袭性呈正相关。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)PD-L1表达情况对小细胞肺癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。
技术实现思路
为了克服晚期或复发小细胞肺癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者PD-L1状态的不足，本专利技术提供了一种小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发小细胞肺癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的PD-L1表达情况。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、PD-L1（人）一抗100μL、山羊抗人IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A0.5mL、试剂B1mL、6×PBS缓冲液60mL；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。进一步的，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成。进一步的，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。进一步的，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。进一步的，所述试剂A为0.6%的羟丙基甲基纤维素水溶液；所述试剂B为乙醇和1，2-丙二醇按照体积比3：1组成。本专利技术还提供了一种利用上述试剂盒非诊断目的检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发小细胞肺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发小细胞肺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测CTC的PD-L1表达情况。本专利技术检测CTC的PD-L1表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μlPD-L1（人）一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl山羊抗人IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入0.5mL试剂A，振荡均匀后，加入1mL试剂B，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、PD-L1（人）一抗100μL、山羊抗人 IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、PD-L1（人）一抗100μL、山羊抗人IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A0.5mL、试剂B1mL、6×PBS缓冲液60mL；所述PBS缓冲液的pH值为7.4。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为0.6%的羟丙基甲基纤维素水溶液；所述试剂B为乙醇和1，2-丙二醇按照体积比3：1组成。


6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测小细胞肺癌患者外周血循环肿瘤细胞PD-L1基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发小细胞肺癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发小细胞肺癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯景阳，李文涛，李琛琛，洪瑛，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37