一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞上C‑MET表达的免疫荧光检测方法包括8%PFA，0.4% PFA，0.3% TritonX‑100，10%山羊血清，兔抗人C‑MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；检测方法包括外周血采集、外周血样预处理、样本分离、甲醇固定、贴膜、组化笔画圈、细胞固定、细胞穿透、封闭、一抗孵育、二抗孵育及核染色、封片及检测。本发明专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肝细胞癌患者C‑MET表达情况，利用微创技术，能够实现实时动态检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。肝癌平均患病年龄44岁。肝病恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年。肝癌早期可无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹有肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等，随着分子生物学的发展，中晚期肝细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展，C-MET(cellular-mesenchymaltoepithelialtransitionfactor，间质表皮转化因子)基因属于原癌基因，编码肝细胞生长因子的跨膜受体，C-MET具有酪氨酸激酶(tyrosinekinase，TKs)活性，C-MET酪氨酸激酶是唯一已知的肝细胞生长因子高亲和性受体，被活化后的C-Met与肝细胞生长因子(HGF)结合，可以调节机体各种组织和细胞的增殖、分化和侵袭活动。一旦构成HGF／C-MET信号通路异常活化，将促进多种肿瘤的发生和发展以及转移。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。针对目前临床实践中，肝细胞癌患者C-MET检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)C-MET表达情况对肝细胞癌患者预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。
技术实现思路
针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发肝细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者C-MET实时动态状态及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法：利用膜过滤装置分离获得晚期肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫荧光技术检测CTC上C-MET表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒，包括375μl8%PFA，200μl0.4%PFA，200μl0.3%TritonX-100，100μl10%山羊血清，兔抗人C-MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；所述的一抗混悬液中兔抗人C-MET、大鼠抗CD45分别用PBS缓冲液按1:100和1:200稀释，混合后总体积为100μL；所述的二抗混悬液中荧光标记的羊抗兔和荧光标记的羊抗大鼠分别用PBS缓冲液按1:100稀释，混合后总体积为100μL。一种利用本专利技术中所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光方法，包括以下步骤：（1）外周血采集：用2mL抗凝管采集无法获取组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者肘正中静脉外周血1mL，后采集5mL作为待检测的外周血样；为确保样本质量，如受试者无其他采血项目，先用2mL抗凝管采集1mL静脉血，该管弃用不作为正式样本；再用BDEDTA抗凝管采集测试样本，样本量保证至少5mL。如受试者有其他采血项目，在其他采血项目完成后采集本测试所需样本，这样可省去采集首管血的步骤；样本保存无需冷藏，室温即可，采集后需要在2小时内进行前处理。如不能在2小时内移交检测，请置于4℃冰箱保存，但应避免隔夜，放置于4℃冰箱保存的样本，处理前至少在室温环境下复温30分钟以上；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样5mL加入15mL离心管中，补加生理盐水至15mL，再加入375μl8%PFA，并轻轻颠倒混匀，室温预固定10min；（3）样本分离：利用膜过滤装置对外周血进行肿瘤细胞分离，获得外周血循环肿瘤细胞；（4）甲醇固定：向膜过滤装置中的滤器中加入500μL甲醇，室温固定1min，去掉多余的甲醇；（5）贴膜：将膜过滤装置中的滤膜取出，在在载玻片左上角滴加5μL甲醇,将滤膜正面朝上贴于玻片，自然晾干10min，滴加10μL的去离子水于玻片上，将晾干的滤膜用镊子揭下后再贴平在滴加有去离子水的玻片处，50℃下处理10min，去除滤膜背面细胞；如果因时间等关系不能马上进行免疫荧光染色，至少应处理至该步，即将滤膜取出贴到载玻片上后，置于4°C进行保存。如果要长期存放，置于-20°C进行保存；（6）组化笔画圈：用组化笔在滤膜周围画一个比滤膜稍大的封闭的圆圈，待2min晾干；（7）细胞固定：向滤膜上滴加200μl0.4%PFA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括375 μl8%PFA，200μl0.4% PFA，200μl0.3% TritonX-100，100μl10%山羊血清，兔抗人C-MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；/n一抗混悬液中兔抗人C-MET、大鼠抗CD45分别用PBS缓冲液按1:100和1:200稀释，混合后总体积为100μL；/n二抗混悬液中荧光标记的羊抗兔和荧光标记的羊抗大鼠分别用PBS缓冲液按1:100稀释，混合后总体积为100μL。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括375μl8%PFA，200μl0.4%PFA，200μl0.3%TritonX-100，100μl10%山羊血清，兔抗人C-MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；
一抗混悬液中兔抗人C-MET、大鼠抗CD45分别用PBS缓冲液按1:100和1:200稀释，混合后总体积为100μL；
二抗混悬液中荧光标记的羊抗兔和荧光标记的羊抗大鼠分别用PBS缓冲液按1:100稀释，混合后总体积为100μL。


2.一种利用权利要求1所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外周血采集：用2mL抗凝管采集无法获取组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者肘正中静脉外周血1mL，后采集肘正中静脉外周血5mL，后采集的5mL作为待检测的外周血样；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样5mL加入15mL离心管中，补加生理盐水至15mL，再加入375μl8%PFA，并轻轻颠倒混匀，室温预固定10min；
（3）样本分离：利用膜过滤装置对外周血进行肿瘤细胞分离，获得外周血循环肿瘤细胞；
（4）甲醇固定：向膜过滤装置中的滤器中加入500μL甲醇，室温固定1min，去掉多余的甲醇；
（5）贴膜：将膜过滤装置中的滤膜取出，在在载玻片左上角滴加5μL甲醇,将滤膜正面朝上贴于玻片，自然晾干10min，滴加10μL的去离子水于玻片上，将晾干的滤膜用...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪瑛，侯景阳，李文涛，李琛琛，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37