一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞上C‑MET表达的免疫荧光检测方法包括8%PFA，0.4% PFA，0.3% TritonX‑100，10%山羊血清，兔抗人C‑MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；检测方法包括外周血采集、外周血样预处理、样本分离、甲醇固定、贴膜、组化笔画圈、细胞固定、细胞穿透、封闭、一抗孵育、二抗孵育及核染色、封片及检测。本发明专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肝细胞癌患者C‑MET表达情况，利用微创技术，能够实现实时动态检测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。肝癌平均患病年龄44岁。肝病恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年。肝癌早期可无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹有肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等，随着分子生物学的发展，中晚期肝细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展，C-MET(cellular-mesenchymaltoepithelialtransitionfactor，间质表皮转化因子)基因属于原癌基因，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括375 μl8%PFA，200μl0.4% PFA，200μl0.3% TritonX-100，100μl10%山羊血清，兔抗人C-MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；/n一抗混悬液中兔抗人C-MET、大鼠抗CD45分别用PBS缓冲液按1:100和1:200稀释，混合后总体积为100μL；/n二抗混悬液中荧光标记的羊抗兔和荧光标记的羊抗大鼠分别用PBS缓冲液按1:100稀释，混合后总体积为100μL。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括375μl8%PFA，200μl0.4%PFA，200μl0.3%TritonX-100，100μl10%山羊血清，兔抗人C-MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；
一抗混悬液中兔抗人C-MET、大鼠抗CD45分别用PBS缓冲液按1:100和1:200稀释，混合后总体积为100μL；
二抗混悬液中荧光标记的羊抗兔和荧光标记的羊抗大鼠分别用PBS缓冲液按1:100稀释，混合后总体积为100μL。


2.一种利用权利要求1所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外周血采集：用2mL抗凝管采集无法获取组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者肘正中静脉外周血1mL，后采集肘正中静脉外周血5mL，后采集的5mL作为待检测的外周血样；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样5mL加入15mL离心管中，补加生理盐水至15mL，再加入375μl8%PFA，并轻轻颠倒混匀，室温预固定10min；
（3）样本分离：利用膜过滤装置对外周血进行肿瘤细胞分离，获得外周血循环肿瘤细胞；
（4）甲醇固定：向膜过滤装置中的滤器中加入500μL甲醇，室温固定1min，去掉多余的甲醇；
（5）贴膜：将膜过滤装置中的滤膜取出，在在载玻片左上角滴加5μL甲醇,将滤膜正面朝上贴于玻片，自然晾干10min，滴加10μL的去离子水于玻片上，将晾干的滤膜用...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪瑛，侯景阳，李文涛，李琛琛，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37