一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法技术

一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法。本发明专利技术方法包括以下步骤：（1）将可溶性淀粉溶液加入Fe

【技术实现步骤摘要】
一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法
本专利技术属于材料领域，具体涉及一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法。
技术介绍
纳米技术是上世纪末迅速发展起来的一门高新技术，包括了微观世界（原子、分子）、微观与宏观的过渡区（纳米领域）和宏观世界，是在传统技术基础之上进行大胆创新的结果。首批研究成果因新颖、独特的思路，在学术研究领域引起了巨大的反响，并受到广泛关注，被称为21世纪的又一次工业革命。随着时代的发展，高精监测仪器的不断推陈出新，纳米技术得到了进一步的成熟和完善。作为纳米
的典型代表，纳米颗粒因具有小尺寸效应，在食品、化工、医学等领域备受青睐。其中，纳米荧光探针作为药物载体材料应用于细胞内的标记及示踪是当今研究的热点项目。荧光标记的生物大分子可用于活体荧光成像、蛋白与蛋白之间的相互作用及蛋白对细胞功能的影响等方面。能作为荧光纳米探针载体的材料有很多，但荧光标记物大部分是有机染料和合成高聚物上，存在不易降解、荧光寿命短、光化学稳定性差、激发光谱窄、光解产物对生物体有毒害等问题，在一定程度上限制了其在细胞生物领域的应用。因此，找到可生物降解、低毒性的生物载体材料成为一件刻不容缓的任务。纳米淀粉颗粒表面易功能化，可与抗原、抗体及多种蛋白质结合，从而在细胞分离、靶向药物、免疫测定等方面具有广阔的市场前景，但纳米淀粉颗粒本身并无发光基团，近年来，科研工作人员利用可生物降解的纳米颗粒与荧光分子结合制成荧光纳米颗粒，增强了荧光分子的光化学稳定性和生物相容性，减轻了细胞毒性和光漂白性，进一步拓展了荧光标记在活体视踪方面的研究，但荧光标记技术中的标记和分离总是研究的难点。在细胞吞噬外来颗粒物的过程中，内吞物首先要经过细胞内一个极为重要的细胞器—溶酶体，才能进行下一步的运输与扩散。溶酶体是一个由单层膜围成的球状体，内含多种水解酶，由于这些酶的最适pH值为酸性，因而称为酸性水解酶，参与细胞内的物质消化。物质进入细胞后，溶酶体会将其消化分解为小分子物质扩散到胞质中，供机体各种生命活动的需要并观察内吞物在溶酶体中的定位情况。目前的溶酶体荧光探针大都是有机染料和合成高聚物，具有比较高的细胞毒性，将可生物降解、安全无毒的淀粉制备成磁性荧光淀粉纳米颗粒进入溶酶体内，可观察到磁性荧光淀粉纳米颗粒在细胞溶酶体中的定位情况，可以进一步了解细胞吞噬的过程及吞噬效果，有利于提高颗粒装载物的利用率。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是，克服以上不足，提供一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒及其制备方法，本专利技术磁性淀粉纳米颗粒具有磁分离特性，低细胞毒性；本专利技术制备方法制备过程中易实现一步标记和分离磁性荧光淀粉纳米颗粒。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：（1）将可溶性淀粉溶液加入Fe3+水溶液中，升温至80～90℃，分散均匀，得混合物溶液；搅拌条件下，将混合物溶液滴加至氨水溶液中，保持pH值为9～11，60℃下，搅拌反应，分离出固体，烘干，得平均直径为200～300nm的磁性淀粉纳米颗粒；（2）将磁性纳米淀粉颗粒与赖氨酸静电结合，得到富含氨基的多聚氨酸淀粉纳米颗粒；（3）将多聚氨酸淀粉纳米颗粒与异硫氰酸荧光素混合，得到异硫氰酸荧光素标记的溶酶体磁性荧光淀粉纳米颗粒。优选的，所述步骤（2）具体为：将1mg磁性淀粉纳米颗粒分散于1mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，摇匀，倒入0.1mg/mL多聚赖氨酸（PLL）的PBS溶液中，在40℃、400r/min摇床震荡条件下反应2h，反应完毕后，离心，弃去上清液，用蒸馏水多次洗涤沉淀，冷冻干燥，得到富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒；优选的，所述步骤（3）具体为：将1mg富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒分散于1mL的PBS缓冲液中，加入0.01～0.1mg异硫氰酸荧光素，在室温条件下，100r/min摇床振荡4h后，加入无水乙醇，有沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水反复溶解，再一次用乙醇醇沉，重复3次，洗涤沉淀，产物为异硫氰酸荧光素标记的磁性荧光淀粉纳米颗粒。优选的，步骤（1）中，每毫摩尔Fe3+加入0.02～0.04g可溶性淀粉，所述可溶性淀粉溶液的为质量百分浓度1～3%的可溶性淀粉水溶液，所述Fe3+水溶液的摩尔浓度为0.02～0.03mol/L。研究发现，Fe3+与可溶性淀粉的量之比对磁性纳米颗粒的形成影响亦较大，仅有当每毫摩尔Fe3+加入0.02～0.04g可溶性淀粉，可溶性淀粉才能完整的包裹Fe3O4磁性颗粒，保证磁性纳米颗粒在具有磁性，且被淀粉完全包裹，进而在后续的步骤形成细胞毒性小的、易被内吞的荧光探针。优选的，步骤（1）中，所述氨水溶液为5MNH3·H2O，氨水溶液的体积与Fe3+水溶液体积比为3～5:5，所述搅拌的转速为100r/min；优选的，氨水溶液的体积与Fe3+水溶液体积比为3:5。研究发现，氨水溶液以及搅拌速度，对磁性纳米颗粒的形成亦有较大影响，当这些参数位于此范围时，才能保证磁性纳米颗粒形貌完整和平均粒径。优选的，步骤（1）中，所述磁性纳米淀粉颗粒的平均粒径为200nm。当淀粉纳米颗粒的平均粒径为200nm时，后续制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒被内吞的量大，细胞毒性小。优选的，步骤（1）中，步骤（1）中，每毫摩尔Fe3+加入0.03g可溶性淀粉，所述可溶性淀粉溶液的为质量百分浓度2%的可溶性淀粉水溶液，所述Fe3+水溶液的摩尔浓度为0.03mol/L。本专利技术制备方法制备的溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术方法制备的溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒可被Hela细胞吞噬，并于红色荧光的溶酶体在HeLa细胞中基本重合，显示出了黄色荧光，成功标记Hela细胞，可作为新型溶酶体标记材料，且Hela细胞对其吞噬量大，细胞毒性小；本专利技术方法制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒华具有磁分离功能，在外加磁场下便于富集和分离，可以进一步应用于细胞、蛋白、DNA等生物分子的分离和分析；相较于普通荧光淀粉纳米颗粒，本专利技术磁性荧光纳米颗粒的取代度更高，在溶酶体中荧光更为稳定有效，能够较长时间的保持荧光性。（2）本专利技术制备方法简单，易操作，原料廉价易得，适宜规模化生产。附图说明图1是实施例1制备的磁性淀粉纳米颗粒和磁性荧光淀粉纳米颗粒的荧光图，其中左图是磁性淀粉纳米颗粒，右图是磁性荧光淀粉纳米颗粒；图2是对比例1制备的荧光淀粉纳米颗粒和实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒在溶酶体中的荧光图，其中，左图为对比例1制备的荧光淀粉纳米颗粒；实施例2制备的磁性荧光淀粉纳米颗粒。具体实施方式以下结合实施例和附图对本专利技术进行进一步的说明。以下实施例采用的试剂和材料若无特殊说明，均是通过常规市售渠道获得。实施例1：本实施例包括以下步骤：（1）将4.5mL2%可溶性淀粉添加到50mL包含0.03MFe3+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）将可溶性淀粉溶液加入Fe

【技术特征摘要】
1.一种溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将可溶性淀粉溶液加入Fe3+水溶液中，升温至80～90℃，分散均匀，得混合物溶液；搅拌条件下，将混合物溶液滴加至氨水溶液中，保持pH值为9～11，60℃下，搅拌反应，分离出固体，烘干，得平均直径为200～300nm的磁性淀粉纳米颗粒；
（2）将磁性纳米淀粉颗粒与赖氨酸静电结合，得到富含氨基的多聚氨酸淀粉纳米颗粒；
（3）将多聚氨酸淀粉纳米颗粒与异硫氰酸荧光素混合，得到异硫氰酸荧光素标记的溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒。


2.根据权利要求1所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：将1mg磁性淀粉纳米颗粒分散于1mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，摇匀，倒入0.1mg/mL多聚赖氨酸（PLL）的PBS溶液中，在40℃、400r/min摇床震荡条件下反应2h，反应完毕后，离心，弃去上清液，用蒸馏水多次洗涤沉淀，冷冻干燥，得到富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒。


3.根据权利要求2所述溶酶体标记磁性荧光淀粉纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）具体为：将1mg富含氨基的多聚赖氨酸淀粉纳米颗粒分散于1mL的PBS缓冲液中，加入0.01～0.1mg异硫氰酸荧光素，在室温条件下，100r/min摇床振荡4h后，加入无水乙醇，有沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖华西，杨帆，林亲录，刘高强，张琳，许东，丁玉琴，文茜，郑湘明，
申请(专利权)人：中南林业科技大学，湖南工业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43