一种通过外周血循环肿瘤细胞检测肝细胞癌患者E-Cadherin基因突变的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E‑Cadherin表达的试剂盒及检测方法，所述的试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、鼠抗人E‑Cadherin一抗、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠二抗、0.1%Triton X‑100、0.3%H

【技术实现步骤摘要】
一种通过外周血循环肿瘤细胞检测肝细胞癌患者E-Cadherin基因突变的方法
本专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部分地区的农村中居第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％，肝癌平均患病年龄44岁。肝癌病理分型为肝细胞癌、胆管细胞癌、混合型肝癌，其中肝细胞癌占70-80%，其恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年左右。肝细胞癌早期无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等，严重影响人类寿命及生活质量。随着分子生物学的发展，中晚期肝细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展，E-钙粘蛋白(E—Cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，E-Cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此E-Cadherin被当做鉴定肝细胞癌E-Cadherin发生的主要手段之一，作为一类细胞表面糖蛋白，E-Cadherein在细胞-细胞之间的粘附中发挥重要作用，并参与组织器官的维持。近年来有关于肝细胞癌E-Cadherin和肿瘤耐药之间的关系日益受到重视，大量研究显示在不同的肿瘤当中由于E-Cadherein的发生而同时耐药性的升高，并且都伴随着E-Cadherin表达的改变。目前，国内外肝细胞肝细胞癌诊治指南均认为：前列腺癌E-Cadherin突变检测的时间点包括初诊时及争取在疾病进展时再次检测，应通过重复检测减少假阳性和假阴性。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。针对目前临床实践中，肝细胞癌患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)E-Cadherin表达情况对肝细胞癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。
技术实现思路
针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发肝细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者E-Cadherin实时动态状态及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本专利技术提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的试剂盒及检测方法：利用膜过滤装置分离获得晚期肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫组化技术检测CTC中E-Cadherin表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、鼠抗人E-Cadherin一抗100μL、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A1mL。优选地，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。优选地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。优选地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。优选地，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。本专利技术中，使用所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测外周血CTC的E-Cadherin表达情况。优选地，步骤（5）所述检测外周血CTC的E-Cadherin表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl抗人E-Cadherin一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl酶标羊抗鼠/兔二抗，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、鼠抗人E-Cadherin一抗100μL、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠二抗100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、鼠抗人E-Cadherin一抗100μL、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠二抗100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A1mL。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.3%硫酸铁+0.5%蔗糖。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为乙醇和多聚甲醛按照体积比3：1组成。


6.一种利用权E-Cadherin利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发肝细胞癌患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文涛，李琛琛，洪瑛，侯景阳，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37