一种通过外周血循环肿瘤细胞检测肾细胞癌患者E-Cadherin基因突变的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测E‑Cadherin基因突变的新方法，尤其是通过外周血检测无法获取组织标本的晚期或复发肾细胞癌患者E‑Cadherin基因突变的方法。该试剂盒包括稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、E‑Cadherin（小鼠）一抗、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体、0.1% Triton X‑100、0.3% H

【技术实现步骤摘要】
一种通过外周血循环肿瘤细胞检测肾细胞癌患者E-Cadherin基因突变的方法
本专利技术涉及一种检测E-Cadherin基因突变的新方法，尤其是通过外周血检测无法获取组织标本的晚期或复发肾细胞癌患者E-Cadherin基因突变的方法。
技术介绍
肾细胞癌(renalcellcarcinoma，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率约占全身恶性肿瘤的2-3％，近几十年其发病呈上升趋势。根治性手术是治疗肾细胞癌的有效手段，但约有20％～30％的肾细胞癌患者就诊时已出现远处转移。即使经历肾细胞癌根治手术，仍有20％～40％的患者会出现复发、转移。既往研究认为，上皮间质转化（EMT）在肾细胞癌复发转移过程中发挥了重要作用，因此监测EMT可用于肾细胞癌的疗效判断及预后评估。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。E-钙粘蛋白(E—Cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，E-Cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此E-Cadherin检测被作为鉴定肾细胞癌EMT发生的主要手段之一。大量研究证实，不同的肿瘤的进展都与EMT的发生有关，且都伴随着E-Cadherin表达的改变。而目前临床实践中，肾细胞癌患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。
技术实现思路
为了克服晚期或复发肾细胞癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者E-Cadherin状态的不足，本专利技术提供了一种肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发非肾细胞癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的E-Cadherin表达情况。本专利技术采用的技术方案如下：一种检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、E-Cadherin（小鼠）一抗100μL、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、6×PBS缓冲液60mL，所述PBS缓冲液的pH值为7.2。进一步地，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%月桂醇聚氧乙烯醚组成。进一步地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。进一步地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。一种利用上述试剂盒非诊断目的检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肾细胞癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发肾细胞癌患外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测CTC的E-Cadherin表达情况。进一步地，所述检测CTC的E-Cadherin表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μlE-Cadherin（小鼠）一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入0.5mL试剂A，振荡均匀后，加入1mL试剂B，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肾细胞癌患者E-Cadherin表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。（2）本专利技术提供的方法，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。附图说明图1为本专利技术的膜过滤装置结构示意图；图2为本专利技术膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；图3为本专利技术膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；图4为肾细胞癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图；图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术阐述如下。本专利技术所使用的试剂盒具体规格如表1所示：E-Cadherin（小鼠）一抗100μL、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体100μL表1组分含量<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、E-Cadherin（小鼠）一抗100μL、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3%H

【技术特征摘要】
1.一种检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、E-Cadherin（小鼠）一抗100μL、连接有辣根过氧化物酶的兔抗鼠抗体100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、6×PBS缓冲液60mL。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1%海藻糖+0.2%月桂醇聚氧乙烯醚组成。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒非诊断目的检测肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发肾细胞癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发肾细胞癌患外周血：肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文涛，李琛琛，洪英，侯景阳，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37