通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者CEA基因表达的免疫荧光试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域，具体的，试剂盒主要包括：山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因组成的一抗混悬液，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液。检测方法主要包括采集外周血，处理外周血，过滤富集循环肿瘤细胞，免疫荧光方法检测循环肿瘤细胞CEA基因表达情况。

【技术实现步骤摘要】
通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者CEA基因表达的免疫荧光试剂盒及检测方法
本专利技术提供了通过外周血循环肿瘤细胞检测结直肠癌患者CEA基因表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，2018年死亡率居恶性肿瘤第四位。在美国，结直肠癌是第三大最常见的恶性肿瘤。在国内，2018年中国全年流行病学数据：结直肠癌的发病率和死亡率均为第5位，年新发病例37.63万，25％被确诊时已发生转移。结直肠癌早期多无症状，出现症状时多为中晚期且有转移。尽管外科手术和化疗方案不断革新，进展期结直肠癌患者的生存率依旧很差。由于结直肠癌尚缺乏较好的预防方法，所以改善结直肠癌预后并提高生存率的最有效的措施就是早期诊断并治疗结直肠早期癌及癌前病变。CEA(carcinoembryonicantigen)是指癌胚抗原，是一种酸性糖蛋白，45％为蛋白质，含有岩藻糖、甘露糖、半乳糖及唾液酸等成分，分子量为150-300KDa，其编码基因位19号染色体。既往研究表明，结肠癌、胃癌、胰腺癌等消化道肿瘤患者血清中CEA均呈现不同程度的升高，CEA被广泛用作各种消化系统肿瘤的诊断及检测指标。随后研究发现，在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、泌尿系肿瘤等其他恶性肿瘤中也有不同程度的阳性率，在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面仍有重要作用。而目前临床实践中，结直肠癌患者CEA检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。针对目前临床实践中，结直肠癌患者CEA基因检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)CEA基因表达情况对结直肠癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。
技术实现思路
针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发结直肠癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者CEA基因实时动态状态，及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本专利技术提供了一种结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得晚期结直肠癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫荧光技术检测CTC上CEA基因表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因表达的免疫荧光试剂盒，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。其中，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+1mmol月硅酸盐+0.1%BSA+0.2%泊洛沙姆组成。其中，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。其中，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。一种利用上述的试剂盒检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因表达情况的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发结直肠癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发结直肠癌患者肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次；（5）向滤器中加入200μl2%PFA，室温固定5min，完成后0.5mlPBS漂洗3次，每次2min；（6）再向滤器中加入200μl预冷的甲醇，4℃固定15min，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（7）运用免疫荧光方法检测外周血CTC的CEA基因表达情况。其中，所述的步骤（7）运用免疫荧光方法检测外周血CTC的CEA基因表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，PBS洗2min×3次；（2）封闭：向滤膜上滴加100μl10%山羊血清，室温放置30min，完成后吸去多余的血清（注：羊血清用PBS稀释）；（3）一抗孵育：向滤膜上滴加100μl小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因组成的一抗混悬液，37℃孵育1h或4℃过夜，完成后PBS洗3min×3次；（4）二抗孵育：向滤膜上滴加100μl荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液，室温孵育30min，完成后PBS洗2min×3次；（5）使用含DAPI的封片剂封片，阅片，采图；（6）采照完成后，脱片后进行瑞氏吉姆萨染色，与IF结果进行对比。本专利技术所使用的膜过滤分离循环肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔；肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞（包括红细胞、白细胞）直径一般小于8微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔的能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；/n一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；/n二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；
一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗CEA基因分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；
二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+1mmol月硅酸盐+0.1%BSA+0.2%泊洛沙姆组成。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒非诊断目的检测结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发结直肠癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发结直肠癌患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文涛，李琛琛，洪瑛，侯景阳，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37