胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E‑Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得晚期胃癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫荧光技术检测CTC上E‑Cadherin表达情况。本发明专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发胃癌患者E‑Cadherin表达情况。本发明专利技术提供的方法，循环肿瘤细胞分离好，能够避免血细胞的干扰，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。标志物E‑Cadherin使用表现出良好的特异性及灵敏度，提升了其在胃癌中的应用。

【技术实现步骤摘要】
胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
胃癌（Gastriccancer,GC）是一种高度致命的恶性肿瘤，发病率居世界第四位（每年新增病例95万例），在2012年肿瘤相关死亡患者中排第三位。尽管近年来胃癌诊断和治疗方法有所改善，但胃癌患者5年生存率还不到30％，大约有50％胃癌患者治愈性切除后遭受肿瘤复发或转移。肿瘤复发和转移是胃癌患者死亡的主要原因。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。E-钙粘蛋白(E—Cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，E-Cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此E-Cadherin被当做鉴定胃癌EMT发生的主要手段之一，作为一类细胞表面糖蛋白，E-Cadherein在细胞-细胞之间的粘附中发挥重要作用，并参与组织器官的维持。近年来有关于胃癌EMT和肿瘤耐药之间的关系日益受到重视，大量研究显示在不同的肿瘤当中由于EMT的发生而同时耐药性的升高，并且都伴随着E-Cadherin表达的改变。目前临床实践中，患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。针对目前临床实践中，胃癌患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)E-Cadherin表达情况对胃癌预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。
技术实现思路
针对现有技术中的检测肿瘤晚期或复发胃癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者E-Cadherin实时动态状态，及现有检测方法容易出现假阳性和假阴性的缺点，本专利技术提供了一种胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得晚期胃癌患者外周血中的循环肿瘤细胞（CTC），进一步运用免疫荧光技术检测CTC上E-Cadherin表达情况。本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。优选地，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1～10g/L山梨醇+0.1%聚甘油脂肪酸酯+PBS缓冲液150mmol/L，其中所述百分比为体积比。优选地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。优选地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。所述的试剂盒非诊断目的检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的方法，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发胃癌患者肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次；（5）向滤器中加入200μl2%PFA，室温固定5min，完成后0.5mlPBS漂洗3次，每次2min；（6）再向滤器中加入200μl预冷的甲醇，4℃固定15min，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（7）运用免疫荧光方法检测外周血CTC的E-Cadherin表达情况。优选地，步骤（7）所述检测外周血CTC的E-Cadherin表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液，PBS洗2min×3次；（2）封闭：向滤膜上滴加100μl10%山羊血清，室温放置30min，完成后吸去多余的血清（注本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A 0.5mL，染色液B 1mL，200μl 甲醇、200μl 2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；/n一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；/n二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL，脱色液1mL，染色液A0.5mL，染色液B1mL，200μl甲醇、200μl2%PFA，100μl10%山羊血清，小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；
一抗混悬液中小鼠抗CK、大鼠抗CD45和兔抗E-Cadherin分别按1:100、1:400和1:500稀释，总体积为100μL；
二抗混悬液中荧光标记的羊抗小鼠、荧光标记的羊抗大鼠、荧光标记的羊抗兔按1:500稀释。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1～10g/L山梨醇+0.1%聚甘油脂肪酸酯+PBS缓冲液150mmol/L，其中所述百分比为体积比。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按体积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.一种利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒非诊断目的检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞E-Cadherin表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血：采集无法获取组织标本的晚期或复发胃癌患者肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪瑛，侯景阳，李文涛，李琛琛，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37