一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的试剂盒及检测方法，利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的CEA表达情况。本发明专利技术提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发胃癌患者CEA表达情况。该技术属于微创，并能够实时检测。本发明专利技术提供的方法，能够避免染色过程中可能产生的边缘效应导致的假阳性结果，稳定性好，降低细胞的损失，提高检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的试剂盒及检测方法
本专利技术提供了一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的试剂盒及检测方法，属于分子生物学

技术介绍
胃癌（Gastriccancer,GC）是一种高度致命的恶性肿瘤，发病率居世界第四位（每年新增病例95万例），在2012年肿瘤相关死亡患者中排第三位。尽管近年来胃癌诊断和治疗方法有所改善，但胃癌患者5年生存率还不到30％，大约有50％胃癌患者治愈性切除后遭受肿瘤复发或转移。肿瘤复发和转移是胃癌患者死亡的主要原因。循环肿瘤细胞（Circulatingtumorcell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。CEA(carcinoembryonicantigen)是指癌胚抗原，是一种酸性糖蛋白，45％为蛋白质，含有岩藻糖、甘露糖、半乳糖及唾液酸等成分，分子量为150000-300000道尔顿，其编码基因位19号染色体。既往研究表明，结肠癌、胃癌、胰腺癌等消化道肿瘤患者血清中CEA均呈现不同程度的升高，CEA被广泛用作各种消化系统肿瘤的诊断及检测指标。随后研究发现，在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、泌尿系肿瘤等其他恶性肿瘤中也有不同程度的阳性率，在恶性肿瘤的鉴别诊断、病情监测、疗效评价等方面仍有重要作用。而目前临床实践中，患者CEA检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。
技术实现思路
为了克服晚期或复发胃癌患者无法实时或反复穿刺获取组织标本、进而不能评估患者CEA状态的不足，本专利技术提供了一种胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的CEA表达情况。本专利技术采用的技术方案如下：一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、CEA（小鼠）一抗100μL、生物素标记的羊抗小鼠IgG100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、1.0mL试剂A、6×PBS缓冲液60mL。优选地，所述稀释液组成为：1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1～10g/L可溶性蛋白+0.1%聚甘油脂肪酸酯+PBS缓冲液150mmol/L，其中所述百分比为体积比。优选地，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。优选地，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。优选地，所述试剂A为二甲苯。上述所述的试剂盒非诊断目的检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测CTC的CEA表达情况。更优选地，所述检测CTC的CEA表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μlCEA（小鼠）一抗，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl生物素标记的羊抗小鼠IgG，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入1.0mL试剂A，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、CEA（小鼠）一抗100μL、生物素标记的羊抗小鼠IgG 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、CEA（小鼠）一抗100μL、生物素标记的羊抗小鼠IgG100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、1.0mL试剂A、6×PBS缓冲液60mL。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液组成为：1mmol/LEDTA+0.1%BSA+0.1～10g/L可溶性蛋白+0.1%聚甘油脂肪酸酯+PBS缓冲液150mmol/L，其中所述百分比为体积比。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为二甲苯。


6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞CEA基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本的晚期或复发胃癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装...

【专利技术属性】
技术研发人员：李琛琛，洪瑛，侯景阳，李文涛，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37