检测外周血循环肿瘤细胞食管鳞癌患者E-Cadherin蛋白表达的非诊断目的方法技术

本发明专利技术提供一种通过检测外周血循环肿瘤细胞食管鳞癌患者E‑Cadherin蛋白表达的非诊断目的方法，具体的，通过试剂盒（稀释液、脱色液、染色液A、染色液B、兔抗人E‑cad抗体、山羊抗兔IgG/HRP、0.1%Triton X‑100、0.3%H

【技术实现步骤摘要】
检测外周血循环肿瘤细胞食管鳞癌患者E-Cadherin蛋白表达的非诊断目的方法
本专利技术涉及一种检测E-Cadherin蛋白表达的新方法，尤其是通过外周血检测无法获取组织标本的晚期或复发食管鳞癌患者E-Cadherin蛋白表达的方法。
技术介绍
食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，约占所有恶性肿瘤的2％。食管癌的病理类型主要包括食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscarcinomaESCC)和食管腺癌(esophagealadenocarcinomaEADC)，在我国的食管癌患者中约90％以上均为食管鳞状细胞癌。近年来随着食管癌诊断技术的不断提高，手术操作技能的不断改进，术前新辅助化疗的应用，再加上术后规律放、化疗的施行，食管癌患者的生活质量在一定程度上逐步得到了改善，但是从整体上而言，食管癌治疗的效果仍然不尽如人意，我国食管癌患者术后的5年总体生存率仅为20％一30％。E-钙粘蛋白(E—Cadherin)是上皮细胞表型最经典的标志物，E-Cadherin表达的下调标志着细胞之间粘附能力的下降，因此E-Cadherin被当做鉴定食管鳞癌EMT发生的主要手段之一，作为一类细胞表面糖蛋白，E-Cadherein在细胞-细胞之间的粘附中发挥重要作用，并参与组织器官的维持。近年来有关于食管鳞癌EMT和肿瘤耐药之间的关系日益受到重视，大量研究显示在不同的肿瘤当中由于EMT的发生而同时耐药性的升高，并且都伴随着E-Cadherin表达的改变。目前，国内外食管鳞癌诊治指南均认为：食管鳞癌患者E-Cadherin突变检测的时间点包括初诊时及争取在疾病进展时再次检测，应通过重复检测减少假阳性和假阴性。而目前临床实践中，食管鳞癌患者E-Cadherin检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。目前，山东省第一医科大学、山东省药物研究院联合山东凯歌智能机器有限公司就循环肿瘤细胞检测鉴定关键技术、检测设备、试剂盒开发与生产进行合作，山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司等单位进行推广应用，本项目为山东省重大科技创新工程项目，以山东第一医科大学济南校区的山东省药物研究院为核心，落实注册人制度，依托循环肿瘤细胞检测鉴定核心诊断技术，进一步注册鉴定诊断试剂盒，以包括PD1、PD-L1、ER、PR、Her-2、GPC-3、VEGF、P53、Vimentin、TKI-EGFR、RAS、CK、ALK-D5F3、CD20、ALK/EML4、Beta-catenin、E-Cadherin、EP-CAM、HPV、IDH-1、PSA、PSMA、VEGF、GFAP、细胞角蛋白、AE1/AE3、雌激素受体、孕激素受体、BCA-225、CA125、CEA、EMA、ERCC1、HPV、Ki-67、P53、TOP2A等作为CTCs表达的示踪剂，注册超灵敏、超快速、高覆盖、低成本、准确特异的鉴定诊断试剂盒，通过与在济南注册的山东凯歌智能机器有限公司、山东祺欣生物科技有限公司、山东喻晓生物科技有限公司、济南杏恩生物科技有限公司、山东发现生物技术有限公司合作进行研发与推广。
技术实现思路
针对现有技术中存在问题，本专利技术提供了一种通过外周血循环肿瘤细胞检测食管鳞癌患者E-Cadherin蛋白表达的方法非诊断目的的检测方法：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的术后食管鳞癌患者外周血中的CTC，进一步运用免疫组化技术检测CTC的PDL-1表达情况。一种检测食管鳞癌患者外周血循环的E-Cadherin蛋白表达的试剂盒，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、兔抗人E-cad抗体（一抗）、山羊抗兔IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A、试剂B、6×PBS缓冲液60mL。其中，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+1mmol月硅酸盐+0.1%BSA+0.2%泊洛沙姆组成其中，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。其中，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。其中，所述试剂A为乙醇和甲醛按照体积比3：1组成；所述试剂B为二甲苯。一种利用上述的试剂盒非诊断目的检测食管鳞癌外周血循环肿瘤细胞PDL-1基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的复发食道鳞癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本食道鳞癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入染色液B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；（5）运用免疫组化技术检测E-Cadherin蛋白表达的情况。其中，所述检测E-Cadherin蛋白表达的具体方法如下：（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；（2）滴加100μl0.1%TritonX-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；（3）滴加100μl0.3%H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；（4）滴加100μl兔抗人E-Cad抗体，室温孵育2h或4℃过夜，PBS洗2min×3次；（5）滴加100μl山羊抗兔IgG/HRP，18～26℃温度下孵育20min，PBS洗2min×3次；（6）滴加100μlDAB显色液，18～26℃孵育并随时在显微镜下观察显色情况，观察时间为3～10min；（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；（9）将返蓝后的CTC采用75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，然后加入0.5mL试剂A，振荡均匀后，加入1mL试剂B，摇动混合均匀后，离心沉淀，将沉淀物采用中性树脂封固；（10）光学显微镜下镜检。本专利技术所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测食管鳞癌患者外周血循环的E-Cadherin蛋白表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A 0.5mL、染色液B 1mL、兔抗人E-cad抗体、山羊抗兔IgG/HRP 100μL、0.1% Triton X-100 100μL、0.3% H

【技术特征摘要】
1.一种检测食管鳞癌患者外周血循环的E-Cadherin蛋白表达的试剂盒，其特征在于，包括稀释液45mL、脱色液1mL、染色液A0.5mL、染色液B1mL、兔抗人E-cad抗体、山羊抗兔IgG/HRP100μL、0.1%TritonX-100100μL、0.3%H2O2100μL、试剂A、试剂B、6×PBS缓冲液60mL。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/LEDTA+1mmol月硅酸盐+0.1%BSA+0.2%泊洛沙姆组成。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱色液是由95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1组成。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂A为乙醇和甲醛按照体积比3：1组成；所述试剂B为二甲苯。


6.一种利用权利要求1-5任一项所述的试剂盒非诊断目的检测食管鳞癌外周血循环肿瘤细胞PDL-1基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的复发食道鳞癌患者外周血中的CTC：采集无法获取组织标本食道鳞癌患者外周血：肘正中静脉外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样采用稀释液进行10倍稀释，稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪瑛，侯景阳，李文涛，李琛琛，
申请(专利权)人：山东凯歌智能机器有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37